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X線結晶構造解析によるABC多剤輸送体の交互アクセスモデルの分子基盤解明

松岡, 敬太 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23134

2021.03.23

概要

ABC（ATP-binding cassette）輸送体は、ATPの結合及び加水分解と共役して基質を能動輸送する膜タンパク質である。その中でもABCB1輸送体は、多種多様な化合物を細胞外へと排出する多剤輸送体であり、さらには薬物体内動態の決定要因の１つであることから、その分子機能解明が待たれている。生体膜に挿入された輸送体のメカニズムについては、内向型状態および外向型状態の間で立体構造が変化し、一方の状態で輸送基質の取り込みを行い、他方で放出を行うという交互アクセスモデルが提唱されている。したがって、ABCB1のメカニズムを理解するためには、この交互アクセスモデルの分子基盤となる内向型と外向型状態の立体構造を解明する必要がある。しかしこれまでに、ABCB1の内向型構造は結晶解析されていたが、外向型構造については解像度の低い構造が明らかにされているだけであった。

申請者は、結晶化能に優れた好熱性真核生物Cyanidioschyzon merolae由来のABCB1（CmABCB1）を用いて種々の部位特異的変異体を作成し、内向型と外向型状態の結晶構造を高分解能で決定した。そして、結晶構造から輸送体機能を担う「装置」を見出し、部位特異的変異体を作成してその役割を解明した。

第一章 QTA変異導入による内向型・外向型状態の結晶構造の決定
CmABCB1は内向型状態の結晶構造のみが得られていた。これは、外向型状態よりも内向型状態が安定なためだと考えられた。そこで、CmABCB1の内向型構造の安定化に寄与すると思われる水素結合に着目し、それを削除する目的でGln147とThr381を Alaに変えるQ147A/T381A（QTA）変異体を作成した。その結果、外向型状態の結晶化に初めて成功し、その構造を1.9 Å分解能で決定することができた。さらに、QTA変異体の内向型構造の結晶も得られたため、同一分子について両状態の構造を初めて明らかにすることに成功した。さらに、両状態の構造変化の支点となる部位を膜貫通ヘリックス（TM）1とTM3の接合部に発見し、TM1–TM3ジョイントと名付けた。このジョイントを構成するGlyやAlaの側鎖の小さなアミノ酸残基は、真核生物に由来する ABCB1で保存されているが、原核生物由来ABCB1ホモログでは保存されていない。後者は、外向型構造になりやすいことから、このTM1–TM3ジョイントの形状が交互アクセスモデルにおける内向構造と外向構造の平衡状態の制御を担う可能性が示唆された。

第二章 TM1–TM3ジョイントの改変による外向型状態への平衡移動
TM1–TM3ジョイントが立体構造変化の平衡状態に及ぼす影響を解明するため、ジョイントを構成するGly132を側鎖の大きいValに変えるG132V変異体を作成し、結晶構造を決定した。その構造は外向型であり、内向型状態の結晶は得られなかった。立体構造の観測からVal側鎖の立体障害によって、細胞膜に対して垂直に並んだTM1とTM3は細胞外側が開くように構造変化していることがわかった。QTA変異によって水素結合を切らなくても、G132V変異だけで外向型状態を安定化できることが判明したことから、ABCB1型のTM1–TM3ジョイントの構造は内向型状態の安定化に寄与していることが示唆された。

第三章 細胞外側の基質排出ゲートの改変が細胞内のATPase部位に及ぼす影響
これまでの構造解析から交互アクセスモデルでは、細胞外側に位置する基質排出ゲートの開閉と細胞内に位置するATPaseドメイン（NBD）の活性との共役が存在する、と予想される。すなわち、内向型状態では、基質排出ゲートは閉じて、NBD二量体は単量体に解離する。一方、外向型状態では、NBDはATPと結合して会合し二量体となり、基質排出ゲートは開く。そして、ATPが加水分解されることで外向型から内向型へと戻る。この一連の構造変化における基質輸送とATPase反応の共役を調べるため、細胞外ゲートに立体障害が加わるような変異体を作製した。基質排出ゲートを構成するTM1とTM6が密接している部位のGly–Glyペアに着目し、一方のGlyをTrpに変えた変異体を作製した。変異体の内向型結晶構造を解析した結果、導入したTrpが基質排出ゲートを押し広げる様子が観測された。つまり、変異が基質排出ゲートを開きやすくしていることが示唆された。そしてATPase活性を測定した結果、分子活性とATPに対する親和性が増大していた。基質排出ゲートの開きやすさがNBD✰ATPase活性に影響を与えることが明らかになり、基質排出ゲートの開閉とATPaseが共役していることが示唆された。

以上、申請者はABC多剤排出輸送体が、内向型状態と外向型状態の立体構造を取りうることを実証し、交互アクセスモデルの分子基盤を明らかにした。また、その立体構造変化を担うTM1–TM3ジョイントを発見し、その役割を明らかにした。さらに、細胞外側の基質排出ゲートを特定し、その開閉とATP加水分解が共役していることを結晶構造に基づいて示した。これらの結果は、ABC多剤排出輸送体メカニズムの根幹となる機能の分子構造基盤を解明したものであり、同輸送体の機能制御を薬物設計の分子構造基盤となるものである。

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