論文の公開元へがん抑制因子ｐ27kip1の新規な機能制御機構の解析
概要
【背景・目的】
悪性腫瘍すなわちがんとは生体内で非制御的に増殖する細胞集団であり，日本において最も死因率の高い疾患である。p27Kip1 (以下p27) は細胞周期を負に制御する細胞周期阻害因子であり，がん抑制因子の一つとして知られている。多くのがんにおいて p27 タンパク質発現量は低レベルに保たれており，プロテアソームによる分解制御即ち量的な抑制制御に関する知見が多く挙げられている。しかしながら，ある程度の p27 発現量を保持するがんも存在することから，p27 制御系は量的な制御のみでは説明できない。
当研究室の先行研究において，マウス線維芽由来正常細胞 NIH/3T3 は p27 高発現下において増殖を著しく停滞させることに比較し，ヒトがん細胞 U-2 OS（骨肉腫由来）と HT1080（繊維肉腫由来）は p27 高発現下であっても増殖があまり抑制されないことが発見された。つまり，がん細胞において量的ではなく質的な p27 の機能抑圧機構および抑圧因子の存在が示唆され，そのような因子は p27 と相互作用する可能性が高いと考えられた。そして， p27 相互作用因子の網羅的探索が行われ，候補因子が多数得られていた。
本研究では，質的な p27 機能抑圧因子の同定と抑圧メカニズムの解明を目的とし，得られた p27 相互作用候補因子から「1. p27 特異的な相互作用因子の探索」と「2. その因子が p27 機能を抑圧する機構に関する分子遺伝学的解析」を行った。さらに，「3. がん細胞種間における p27 機能抑圧に関する一般性・特異性」の検証を行った。p27 の質的な機能抑圧機構の解明は，がん化や腫瘍増大メカニズムに関する理解を深めると共に，新しい観点からのがん治療に貢献すると考える。
【方法・結果】
第１章 p27 特異的な相互作用因子の探索
p27 機能抑圧因子は p27 と相互作用する可能性が高いと考え，プロテオーム解析により p27 相互作用因子の探索が行われた結果，29 種の候補因子が得られていた。はじめに，その 29 種の因子の中から真に p27 と相互作用する因子を効率良く探索すべく yeast two-hybrid assay（以下 Y2H）による相互作用解析を行った。候補因子の cDNA はがん細胞 U-2 OS 由来 cDNA から単離し，prey タンパク質発現ベクターに導入した。また，p27野生型とcyclin への結合能を欠損したp27 RXL 変異型をbait タンパク質発現ベクターに導入した。Y2H の結果，nucleophosmin isoform 1（以下 NPM1）が p27 と相互作用することが見出された。また同時に NPM1 は p27 RXL とは相互作用しないことも示された。このことからNPM1 は p27 タンパク質の cyclin が結合する部位に結合する事が予測された。次に，動物細胞内における p27-NPM1 の相互作用解析を共免疫沈降法により行った。対象細胞として，Tet-on system を用いた p27 誘導発現系 (Tet-on p27) が導入されたがん細胞U-2 OS と HT1080，正常細胞 NIH/3T3 を用いた。その結果，3 細胞種において p27-NPM1 の相互作用が確認されたが，その相互作用は正常細胞よりもがん細胞 2 種で強く観察された。以上より，新規な p27 相互作用因子として NPM1 を同定した。
第２章 NPM1 による p27 機能抑圧に関する分子遺伝学的検証 2-1 NPM1 による p27 の質的な機能抑圧
NPM1 は核小体タンパク質であり，リボソーム生合成等に関与する。また，がん抑制因子 p53 の上流因子である p14 alternative reading frame（以下 ARF）の機能を阻害することで細胞増殖を促進すること，多くのがん細胞で高発現していることが報告されている。そこで，本研究の研究対象であるがん細胞 U-2 OS と HT1080，正常細胞 NIH/3T3 とMRC-5（ヒト肺線維芽由来）における NPM1 のタンパク質発現量を比較した。その結果，U-2 OS， HT1080 の NPM1 タンパク質発現量は NIH/3T3 の約 1.7 倍，MRC-5 の約 2.5 倍であることが示された。
本研究では NPM1 のがん細胞における高発現に注目し，この高発現が p27 の質的な機能抑圧に寄与すると予測した。そこで，NPM1 高発現正常細胞株とNPM1 低発現がん細胞株を作製することによる分子遺伝学的検証を行った。上記の仮説が正しければ，p27 依存的な増殖抑制が NPM1 高発現正常細胞株では緩和され，NPM1 低発現がん細胞株では促進されると考えられる。NPM1 高発現正常細胞株は NIH/3T3 Tet-on p27 に NPM1 高発現系を， NPM1 低発現がん細胞株は U-2 OS，HT1080 Tet-on p27-EGFP に shRNA による NPM1ノックダウン系を，それぞれレトロウイルスベクターにより安定導入して作製した。それらの細胞株を用いて p27 誘導発現下または非誘導発現下で細胞増殖を比較し，増殖率（p27誘導下の細胞数 / p27 非誘導下の細胞数）を算出することで p27 の機能評価を行った。そ の結果，正常細胞 NIH/3T3 Tet-on p27 の NPM1 高発現株は非高発現株と比較し増殖率が 有意に上昇した。一方で，がん細胞 U-2 OS，HT1080 Tet-on p27-EGFP の NPM1 ノック ダウン株は非ノックダウン株と比較し増殖率が有意に低下した。また，NPM1 タンパク質 発現量依存的な p27 タンパク質発現量の大きな変化は確認されなかった。これらのことか ら，がん細胞における NPM1 の高発現が p27 機能を質的に抑圧することが示唆された。さ らに，がん細胞の高発現 NPM1 による p27 機能抑圧が腫瘍増大に与える影響を検証するた め，異種移植実験を行った。ヌードマウスに HT1080 Tet-on p27-EGFP の NPM1 ノックダ ウン株または非ノックダウン株を皮下移植し，p27 誘導発現下または非誘導発現下で腫瘍成 長を観察した。その結果，p27 誘導発現下でのHT1080 Tet-on p27-EGFP NPM1 ノックダ ウン株由来の腫瘍の増大は，非ノックダウン株由来の腫瘍の増大と比較し有意に抑制された。以上のことから，がん細胞における NPM1 の高発現は p27 機能の抑圧を介してその細胞増 殖だけでなく腫瘍増大を促進することが示唆された。
2-2 がん細胞における p27 の局在解析
前述の NPM1 による ARF の機能阻害は NPM1 が ARF に結合し核小体に隔離することで生じる。そこで同様に p27 も NPM1 により核小体に隔離されるのではないかと考えた。 NPM1 と p27 の局在解析を行い，がん細胞特異的な p27 の局在異常の有無を検証した。その結果，p27 は NIH/3T3 では核質に局在するのに対し，U-2 OS では核質に加え核小体にも局在し，NPM1 と共局在することが観察された。p27 は本来核質で機能するタンパク質であり，核小体局在は異常な局在であると考えられた。
2-3 ARF-NPM1-p27 の関係性
一方で，NPM1 と ARF は拮抗関係にあり，ARF が NPM1 のポリユビキチン化とそのタンパク質の分解を促進するという報告がある。また，ARF は多くのがん細胞において欠損または発現抑制されていることが知られている。故に，ARF の抑制が NPM1 による p27の機能抑圧に関与しているのではないかと考えた。はじめに，本研究の対象がん細胞である U-2 OS とHT1080 の ARF タンパク質発現を解析した。その結果，ARF タンパク質発現はポジティブコントロールの Saos-2（ヒト骨肉腫由来）では明確に検出できるのに対し，がん細胞 U-2 OS，HT1080 ではプロテアソーム阻害剤処理下でも検出されなかった。このことから，がん細胞 U-2 OS と HT1080 において ARF の遺伝子欠損またはプロテアソーム分解以外の発現抑制が考えられた。次に，この ARF の抑制が高発現 NPM1 による p27 機能抑圧に寄与するのか検証するため，がん細胞 U-2 OS へ ARF を一過的に導入し p27 の局在を観察した。その結果，がん細胞 U-2 OS において ARF 導入依存的に NPM1 のタンパク質発現量の低下と同時に p27 の核小体から核質へ局在の変化が確認された。つまり，ARF の遺伝子欠損または発現抑制が p27 の核小体局在に寄与することが示唆された。
以上のことから，がん細胞において ARF の遺伝子欠損または発現抑制に起因するNPM1の高発現が p27 機能を抑圧し，細胞増殖と腫瘍増大を促進することが示唆された。
第３章 がん細胞種間における p27 機能抑圧に関する一般性・特異性
新規がん細胞を加えた p27 機能抑圧の検証
本研究のこれまでの研究は２種のがん細胞 U-2 OS と HT1080 を対象としていた。がんは由来する組織や臓器によってその細胞特性が異なっており，治療標的分子も様々である。本研究の応用性を拡大するため，がん細胞種間における p27 の質的な機能抑圧の一般性を検証した。新たに 3 種のヒトがん細胞 DAOY（髄芽腫由来）と A431（上皮がん由来）， MDAH041（Li-Fraumeni 症候群線維芽由来）を加え p27 誘導発現系を導入し，p27 機能評価のため細胞増殖検定を行った。その結果，p27 誘導発現下において，DAOY と A431は大きな増殖抑制を示さなかったが MDAH041 のみ顕著な増殖抑制を示した。このことから，全てのがん細胞において p27 機能が抑圧されるわけではないことが示唆された。
また，それらのがん細胞種における ARF-NPM1-p27 の相関性を調べるため，NPM1 と ARF のタンパク質発現量を解析した。その結果，3 種のがん細胞間で NPM1 タンパク質発現量に大きな差は観察されなかったが，MDAH041 のみ ARF タンパク質の発現が検出された。つまり，p27 発現依存的な増殖抑制を示さない細胞種では ARF の発現が抑制されており，増殖抑制を示した細胞種では ARF が発現していたことから，種々のがん細胞株において p27 機能と ARF のタンパク質発現に相関性があることが示唆された。また，ARF 発現の有無に関わらず NPM1 のタンパク質発現量に差がなかったことから，p27 が機能するためには NPM1 の低レベルの発現または ARF の発現が必要であることが示唆された。
【総括】
本研究において NPM1 を新規な p27 相互作用因子として同定し，がん細胞における NPM1 の高発現が p27 機能を質的に抑圧し細胞や腫瘍の増殖を促進することを発見した。しかしながら p27 と NPM1 の相互作用部位の正確な同定が必要と考える。なぜならば， p27-NPM1 相互作用部位を標的とした阻害分子の細胞内導入により，p27 の機能が回復する可能性があるためである。つまり，新規な抗がん剤の開発に寄与すると期待される。
また，p27 が機能するためには ARF の発現が重要であることを見出した。ARF の発現が NPM1 発現量の減少または p27-NPM1 相互作用阻害に寄与すると考えられるが，特に後者においては詳細な解析が進んでいない。ARF は多くのがんで遺伝子変異や発現抑制により不活化していることから，それらのがんにおいて p27 が機能していないことが予測される。つまり，p27 の機能回復は多種のがん治療に寄与する可能性があり，本研究における ARFの関わる p27 制御機構の発見と今後の更なるメカニズム解明はその糸口になると期待される。
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