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無電解メッキ技術を利用する光ファイバー表面プラズモン共鳴センサー作製技術の確立

森田 健司 東京薬科大学

2021.03.19

概要

バイオエンジニアリングによる次世代の高度医療の実現には， 人の個体から組織・臓器， 細胞， 分子レベルで生命現象を捉えることが要求され， これら“ 生きた生体試料” を対象として， 生体分子の動態を“ その場” 計測するための技術革新が要求されている． 光ファイバー表面プラズモン共鳴 (SPR) センサーは， “ノンラベル”かつ“リアルタイム”で生体分子を計測できる利点を有するとともに，センサーの微小化が可能である点において， “その場”計測技術への応用も期待できる． しかしながら， 現時点ではまだ， 光ファイバー SPR センサーの作製技術が成熟しておらず，要求されている計測レベルには到達していない．

そこで本研究では，光ファイバー SPR センサーの作製法として， 無電解メッキ技術に着目し， 光ファイバーに金ナノ薄膜を膜厚 50 nm の精度で被覆する新たな技術の確立を図り， さらに作製したセンサーを用いる“その場”バイオセンシングへの応用について検討した． まず第一章では， 光ファイバー表面への無電解メッキ処理に際して， nm レベルの膜厚変化をモニタリングするための指標として光ファイバーの端面におけるリアルタイム吸光度計測を行い， 被覆するナノ薄膜の膜厚を高精度に制御する手法について検討した．第二章では，前章の手法を適用した無電解 Ni/Au メッキ技術による実用的で高感度な光ファイバー SPR センサーの作製法の確立を図るとともに， 細胞近傍の“その場”バイオセンシングへの光ファイバー SPR センサーの応用例として，試作したセンサーのエクソソームに対する応答や検出性能について検討した．

第一章 吸光度を指標とする金属ナノ薄膜の膜厚モニタリング技術の確立
ナノメートルレベルの金属薄膜を堆積させる技術として， 真空蒸着法やスパッタリングが一般的に利用されている． これらの技術は， 平面基板に金属ナノ薄膜を被覆する際には有効であるが， 立体的な構造体を被覆する場合には無電解メッキ技術の方が適しており， かつ簡便な手法である． しかしながら， 無電解メッキでは厳密な膜厚制御が困難という問題があるため， これを克服する手段として， 膜厚をモニタリングしながら無電解メッキ処理を行うことが有効であると考えた．

光ファイバー先端に被覆される金属ナノ薄膜の膜厚をモニタリングする手法として，ファイバー端面の吸光度をリアルタイムで測定することを検討した． 光ファイバーの 端面から 458 nm の波長の光を入射しながら無電解メッキ処理を行うと， ファイバー 先端の金属ナノ薄膜の膜厚が増加するに従い， ファイバー端面を透過する光強度が減 少するものと考えられる．透過光強度から換算した吸光度を指標とすることで，nm レ ベルの膜厚変化をモニタリングできるものと期待される． そこで， 単純な無機化学反 応である銀鏡反応をモデルとして， 銀ナノ薄膜形成時の膜厚をモニタリングする指標 としての吸光度の測定に着手した． 光源と分光器に対して， 被めっき物となる光ファ イバーを一直線上に配置できる装置を自作した(Fig. 1)．

Fig. 1 A real-time monitoring system for thickness of a silver thin film formed during the silver-mirror reaction.

装置内に取り付けたトレンス試薬に光ファイバーの先端を浸漬させると， 銀鏡反応の進行とともに吸光度が増加した (Fig. 2a)． 銀鏡反応後の銀ナノ薄膜の膜厚を原子間力顕微鏡 (AFM) で計測し， その膜厚に対して光ファイバーをトレンス試薬から取り出したときの吸光度をプロットしたところ， 比例関係が成立することが明らかとなった(Fig. 2b)． このことから， 吸光度を指標として， 銀ナノ薄膜の膜厚変化をモニタリングできることを実証できた． さらに， 実際の銀ナノ薄膜上での SPR 誘起を確認するため， 膜厚モニタリングにより光ファイバーに対して 50 nm の銀薄膜を被覆し， 光ファイバー SPR センサーを作製した． 作製した光ファイバー SPR の検出感度は， 2205 nm / RIU であり， 十分な計測性能を示していた．

Fig.2 (a) Time course of absorbance at 458 nm during the silver-mirror reaction. (b) Relationship between the absorbance value of the silver thin film observed using the system and the thickness measured by AFM

第二章 無電解 Ni/Au メッキ技術による光ファイバーSPR センサーの作製技術の確立とバイオセンシングへの応用
前章で示したように，銀ナノ薄膜上で SPR を誘起することは可能であり，試作した SPR センサーは金ナノ薄膜よりも高感度計測に適しているが，酸化されやすいため長期保存は難しい．そのため実用面から，一般的な SPR センサーにはガラスに金薄膜を被覆させたものが用いられている． しかしながら， 無電解金メッキ技術により， 光ファイバーに金ナノ薄膜を被覆する SPR センサーの作製に成功した事例は皆無である．そこで本章では，無電解 Ni/Au メッキ技術による光ファイバー SPR センサーの作製法を確立した． このメッキ反応は銀鏡反応よりも複雑であり， 具体的な工程は以下の通りである．まず，ガラス製の光ファイバーに触媒となるパラジウムを吸着させ，メッキ処理によりガラスとの密着性に優れたニッケルを被覆させた． その後， イオン化傾向の差を利用して，ニッケルを溶出させるとともに金を被覆させた（ 置換メッキ）．その際，厳密に 50 nm の膜厚で光ファイバーに金ナノ薄膜を再現よく被覆するためには， ニッケルメッキおよび置換型の金メッキ反応処理中において， 膜厚変化をモニタリングする必要がある． 単純な Ni メッキ反応では， 銀鏡反応と同様に， 光ファイバーをメッキ浴から引き上げたときの吸光度とナノ薄膜の膜厚には比例関係が成立した．一方，ニッケルがすでに被覆されている光ファイバーを用いる Ni/Au 置換メッキ反応では， 吸光度で膜厚変化を測定することができないため， 膜厚モニタリングの指標として反射率を適用した． ニッケルと金の反射率が異なるため， メッキ反応の進行とともに反射率が変動した． ファイバー表面にニッケルが極微量しか残存しなくなった時点で， 反応速度が著しく低下し， 反射率は飽和した． ニッケルおよび金ナノ薄膜の膜厚を反射率でモニタリングすることで， 光ファイバー SPR センサーを作製する際の最適条件を決定した． 最適条件で作製した光ファイバー SPR センサーで計測した SPR スペクトルを Fig. 3a に示す． SPR シグナルは金薄膜の界面の屈折率に応じて変化する．屈折率の標準物質として，化学的・物理的に安定なスクロースを用いて，センサーの性能を評価した．SPR スペクトルは，スクロース濃度に依存して長波長側にシフトした．濃度に対して， スペクトルの極小値である SPR 波長の変化量をプロットしたところ，非常に良好な相関関係を得ることができた(Fig.3b)．また，検出感度は 1809 nm / RIU と見積もられた． これは既報の真空蒸着法やスパッタリング法で作製されたセンサーとほぼ同等の感度であった．

Fig.3 Performance of the SPR sensor prepared using the developed technique.
(a) SPR spectra obtained from measuring sucrose solutions with different concentrations(0 -16w/v %).(b) The calibration curve for sucrose (n = 3).

確立した技術で作製した光ファイバー SPR センサーが， 生体機能の理解に有用な “ その場” 計測技術に応用できる可能性を示すために， エクソソームに対する応答性能を調べた． エクソソームの計測技術は未だに未成熟であるため， 物理的， 化学的な内外の刺激に対する細胞からのエクソソームの分泌量に関する基本的な情報は不足している．そこで，光ファイバー SPR センサーの金薄膜表面に anti-CD 63 抗体を物理的に吸着させて， エクソソームの個数依存的な応答を観測した． テトラスパニンの膜タンパク質である CD63 は，エクソソームのマーカーとして，イムノアッセイ等で利用されている． 種々の濃度の乳がん細胞 (MCF-7) 由来のエクソソームを含む溶液にセンサーを浸漬したところ，エクソソームの個数が増加するとともに，SPR 応答が大きな値を示した(Fig.4)．このセンサーでは，エクソソームを“ノンラベル”かつ“リアルタイム”で計測できるだけでなく，センサーが微小サイズであることから，細胞近傍における“その場”計測も可能であると考えられる． また， 本法は， ELISA 等の既存のエクソソーム計測法よりもエクソソームの検出感度に優れていた．

Fig.4 (a) A sensorgram for 20,000 particles of MCF-7 exosomes (b) The calibration curve of MCF-7 exosomes. Slope values were estimated the sensorgrams at the range form 60-300 sec.

総括
光ファイバーに金属ナノ薄膜を被覆する手段として， 複雑な構造体に金属被膜を形 成させる無電解メッキ技術が適しているが， nm オーダーで金属ナノ薄膜の膜厚を制 御することが課題であった． 本研究では， 無電解メッキ反応により変化する金属ナノ 薄膜の膜厚をリアルタイムでモニタリングすることにより， この課題を解決した． 無 電解メッキ処理時における金属ナノ薄膜の膜厚モニタリング技術を開発した例はなく， nm レベルの膜厚を計測する際に， 吸光度や反射率がその指標として利用できること を実証した例もない． 本研究で確立した光ファイバー SPR センサーの作製技術は， 従来の作製技術を革新するものである．光ファイバー SPR センサーは，“ ノンラベル かつリアルタイム” に生体高分子を“ その場” 計測できる可能性を秘めており， 生体 機能の理解が求められる研究領域の発展に貢献しうるものとして期待される．

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