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Alternative splicing of APOBEC3D generates functional diversity and its role as a DNA mutator

武井, 寿史 タケイ, ヒサシ Takei, Hisashi 群馬大学

2021.03.23

概要

Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like (以下；APOBEC)タンパク質ファミリーは核酸のシチジンをウラシルに変換するシチジンデアミナーゼ活性をもつタンパク質群であり、11種類（APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3；7種、APOBEC4、activation-induced cyti dine deaminase）のタンパク質から構成される。APOBECは、ヒト免疫不全ウイルス（以下；HIV）などのウイルスの核酸に変異を誘導することや、免疫グロブリンの多様性に必要な体細胞超突然変異やクラススイッチに関わることで、免疫機構の一端を担っている。また近年、APOBECタンパク質ファミリーの一部が体細胞変異を誘発し、がんの発生や治療薬に対する耐性を誘導することが報告されている。APOBECタンパク質ファミリーの1つであるAPOBEC3D（以下；A3D）もHIVに対する変異誘導活性を持つことが知られている。しかし、A3Dが体細胞変異を誘導し、がんの発生への関与については不明な点が多い。我々は、A3Dが体細胞変異を誘導することで、白血病などのがんの発生に関わる、という仮説を立て実験を行った。

まず初めに、正常人の末梢血単核球（Mononuclear cell；以下MNC）と5種類の白血病細胞株におけるAPOBEC3遺伝子の発現を、リアルタイムPCRを用いて解析した。A3B、A3C、A3D、A3F、A3GがMNCおよび白血病細胞株に発現していた。次に、A3Dをクローニングするために白血病細胞株、肺癌細胞株のDNAを用いてPCRを行ったところ複数のバンドが検出された。各バンドの塩基配列解
析を行い、6つのA3Dバリアント（A3Dv1, v2, v3, v4, v5, v6）を認めた。また、Emsemblに報告されていたバリアント（A3D-203）をA3Dv7として、A3Dは7つのバリアントを有していることが確認された。A3Dv3, v4, v5の塩基配列はシチジンデアミナーゼ活性ドメインの5’側に終始コドンを有しており、酵素活性を有すると考えられたA3Dv1, v2, v6, v7に注目した。

続いて、A3Dv1, v2, v6, v7がRNAウイルスであるHIVに与える影響を確認するため、HEK293T細胞にA3Dを強制発現させ、その後HIVを感染させた。コントロールと比較して、A3Dv1, v2, v6, v7の全てのバリアントで80-90%程度のHIV感染能の低下を認めた。HIVのgag遺伝子配列を解析したところ、コントロールと比較して全てのバリアントで変異頻度の増加が確認された。また、シチジンデアミナーゼ活性ドメインに変異を持つA3Dv1-E80/264QおよびA3Dv6-E264Qを用いてHIV感染能を確認したところ、A3Dv1, v6と比較してHIV感染能の回復が見られた。

次に、A3DがDNAに与える影響を確認するため、外来DNA編集アッセイを行った。HEK293T細胞にA3D発現ベクターとEGFP発現ベクターを同時に導入し、EGFP発現やEGFP遺伝子の変異頻度を評価した。陰性コントロールと比較して全てのA3DバリアントでEGFP陽性細胞率の減少と、EGFP遺伝子の変異頻度の増加が認められた。A3Dv1-E80/264QおよびA3Dv6-E264Qを用いたところ、陰性コントロールと同等のEGFP陽性細胞率であった。

続いて、A3Dが体細胞DNAに与える影響を確認するためゲノムDNA編集アッセイを行った。HEK293T細胞にA3D発現ベクターを導入し、HEK293T細胞のTP53遺伝子における変異頻度を評価した。陰性コントロールと比較して、A3v1, v2, v6を強制発現した群で変異頻度の増加が見られた。

外来DNA編集アッセイ及びゲノムDNA編集アッセイで、A3Dや陽性コントロールとして用いたA3Bを強制発現させた群において、点変異だけでなく遺伝子欠失が確認された。EGFP遺伝子では47-415 bpsの欠失と1-9 bpsの短い相同配列、TP53遺伝子では1-340 bpsの欠失と1-3 bpsの短い相同配列が見られた。EGFP遺伝子やTP53遺伝子の遺伝子欠損部位に見られた短い相同配列（マイクロホモロジー）は、A3DやA3Bによって誘導された点変異が、DNA修復メカニズムの1つであるマイクロホモロジー媒介末端結合によって遺伝子欠失が発生した可能性を示唆していた。

我々の行った実験結果は、A3Dが白血病細胞株に発現していること、A3Dは7つのバリアントが存在していることを示した。そのうち4つのバリアント（A3Dv1, v2, v6, v7）は変異誘導活性を有し、HIVのgag遺伝子、EGFP遺伝子、TP53遺伝子に変異を誘導することが確認された。

A3Dがどのように体細胞遺伝子変異を誘導し、そのことががんの発生にどのような役割を持つのかを解明するため、更なる研究が必要である。

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