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Characterization of a BAC transgenic mouse expressing Krt19-driven iCre recombinase in its digestive organs

金山, 知弘 岐阜大学

2020.03.25

概要

サイトケラチン 19（Krt19）は消化器をはじめとする内胚葉系臓器の上皮細胞に発現している分子である。このような Krt19 の発現特性を利用し，Krt19 遺伝子発現制御領域支配下に Cre DNA 組換え酵素を発現する Krt19-Cre マウスや Krt19-CreERT マウスが作製されており，消化器臓器特異的に遺伝子改変を行うためのツールとして広く活用されている。しかし，これらの既存の Cre ドライバーマウスでは Cre 遺伝子のサイレンシングや異所的発現が起こることが報告されており，改良の必要性が指摘されている。本研究ではこれらの問題点を克服するために，Krt19 遺伝子発現制御領域を含む大腸菌人工染色体（BAC）に改良型Cre（improved Cre:iCre)を組み換えたコンストラクトを用いて Krt19- iCre トランスジェニックマウスを新たに作製するとともに，作製したマウスの Cre/LoxP 組換え効率とその特異性について解析を行った。

【対象と方法】
大腸菌相同組換え技術を用いて，Krt19 遺伝子領域を含む BAC クローンの Krt19 遺伝子の翻訳開始点に iCre-polyA-FRT-neo-FRT カセットを挿入したコンストラクトを作製した。作製したコンストラクトを B6D2F1 マウス受精卵の前核に注入することによって，12 匹のトランスジェニックマウスを得た。これらのうち，健康や妊孕性に問題がないものについて Cre レポーターマウス(B6.129S4- Gt(ROSA)26So rtm1Sor/J:LacZflox/flox)との交配を行い，LacZ の発現を指標に Cre/LoxP 組み換えが起こる系統を選別した。組み換えが確認された 2 系統について，詳細な組織学的解析を行った。このために， Krt19-iCre マウスと LacZflox/flox マウスまたは蛍光タンパク質(tdTomato)を発現する Cre レポーターマウス(B6;129S6-Gt(ROSA)26Sor tm9(CAG-tdTomato)Hze/J:tdTomatoflox/flox)とを交配させ，得られた胎仔および成体マウスから組織を採取した。採取した組織を用いて，免疫組織染色，in situ hybridization (ISH) 染色，および X-gal 染色を行い Krt19-iCre マウスの組換え効率と特異性を調べた。また，岐阜大学医学部附属病院病理診断科の組織標本を使用し，ヒトの KRT19 発現との比較解析を行なった。

【結果】
1. Krt19-iCre マウスの消化器臓器における iCre mRNA 発現とその局在
ISH によって Krt19-iCre 成体マウスの消化器臓器における iCre mRNA の発現パターンを調べた。その結果，食道，胃噴門・体部・幽門，十二指腸，空腸・回腸，および結腸の上皮層全域にわたって iCre mRNA が発現していることが認められた。また，肝内胆管，総胆管，および膵管の管上皮においても iCre mRNA の発現が確認された。iCre mRNA の発現パターンは内因性 Krt19 タンパク質の発現とほぼ一致していたが，小腸では iCre mRNA 発現が上皮の増殖帯だけに限局していた。また，胆管上皮での iCre mRNA の発現量は，他の消化器臓器と比べて低レベルであった。

2. 消化器臓器における iCre タンパク質発現と Cre/LoxP 組換えの特異性の解析
Krt19-iCre；tdTomatoflox/+ マウスについて抗 Red Fluorescent Protein (RFP)抗体による蛍光染色を行い，tdTomato レポータータンパク質の発現パターンを調べた。その結果，消化器臓器の上皮に限局して tdTomato が発現していることが認められた。また，内因性 Krt19 タンパク質と iCre タンパク質の発現を免疫組織染色によって調べたところ, 小腸を除く消化器臓器では内因性 Krt19 タンパク質と iCre タンパク質の発現パターンが一致していることが確認された。これに対し，小腸では iCre タンパク質の発現が上皮の増殖帯だけに限局していた。

3. 発生期の Krt19-iCre マウスにおける Cre/LoxP 組換えの解析
Krt19-iCre;LacZflox/+マウスの胎仔および新生仔について LacZ の発現パターンを調べた。胎生9.5 日胚(E9.5)のホールマウント X-gal 染色を行ったところ，LacZ の発現は前腸と皮膚の一部にのみ認められ,内因性 Krt19 の発現パターンと一致していた。また，E12.5, E17.5, および新生仔（P0）では，消化器臓器の上皮に LacZ の発現が認められた。さらに，P0 では胆管上皮と一部の肝細胞および膵外分泌細胞においても LacZ の発現が観察された。

4. ヒト消化器臓器における KRT19 発現パターンの解析
ヒトの消化管，肝胆道膵臓器の正常組織を用いて KRT19 の免疫組織染色を行った。消化管上皮，胆管上皮，膵管上皮と一部の外分泌腺において KRT19 タンパク質の発現が確認され，その発現パターンは，Krt19-iCre；tdTomatoflox/+マウスの tdTomato レポータータンパク質の発現とほぼ一致した。なお，Krt19-iCre マウスでは胆管上皮での iCre の発現が低位であったが，ヒトの胆管上皮での KRT19 タンパク質の発現強度は他の消化管上皮と同レベルであった。

【考察】
既存の Krt19-Cre マウスや Krt19-CreERT マウスでは，胎生期から新生仔期までの段階における Cre/LoxP 組換えの詳細な解析は行われていない。また，これらのマウスでは，発生期に異所的な組み換えやモザイク状の組み換えが起こることが報告されている。一方，本研究では Krt19-iCre マウスを用いて解析を行い，E9.5 から P0 マウスにおいて内在性 Krt19 タンパク質の発現と一致した Cre レポーター分子の発現を認めた。また，成体マウスにおいても Cre レポータータンパク質と内在性 Krt19タンパク質の発現が一致していることが確認された。以上のことより，本研究において作製された Krt19-iCre マウスは，既存のマウスの問題点が改善されており，内在性 Krt19 タンパク質の発現を忠実に反映して Cre/LoxP 組換えを誘導することが可能であると考えられた。

【結論】
本研究により，消化器臓器の上皮の発生の仕組みや疾患の発症機序を分子遺伝学的手法によって解析する際に有用となる Cre ドライバートランスジェニックマウスを作製することができた。

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