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固体ナノポアを用いた核酸配列検出法に関する研究 (本文)

柳, 玲奈 慶應義塾大学

2021.03.23

概要

ヒトのDNA（デオキシリボ核酸：Deoxyribonucleic acid）は 30 億塩基対の長さを有し，37 兆個あるとされる各細胞核内に収容されている[1]。個々の細胞は複雑かつ柔軟に活動し，細胞間で相互作用することで，生体機能の正常な働き，異常な働きを起こす。これら細胞の働きは，細胞内で機能しているタンパク質によって制御されている。細胞の機能や細胞間の相互作用に重要な働きを担うタンパク質は，DNA にプログラムされた情報に基づき，適材適所で生産される。タンパク質が適切なタイミングで適切な量生産されることも，この DNA 及び，既に生産されたタンパク質と DNA の相互作用により決定される。そのためこの DNA の塩基配列を解読すること（シーケンシングすること）は，生物の根幹をなす情報を得ることになる。これら各情報は，遺伝子と呼ばれる，数百塩基から数千塩基の長さを有する４種（アデニン，チミン，グアニン，シトシン）の塩基の組み合わせに書き込まれている。遺伝子は，疾患，薬剤耐性，外見，性格などに関連するタンパク質の生産に携わる。この遺伝子を元に，個人の体質・病状に合わせて適切な投薬や治療，予防法を選択できるゲノム医療の実現が期待されている。この医療を下支えるのは，疾患と遺伝子の未知の相関を探求するための遺伝子解析技術の向上と，臨床現場において幅広く利用可能なレベルへのコスト低減である。

これまで遺伝子を解析する手段として DNA シーケンサが使われてきた。DNA シーケンサは，熾烈な開発競争を経て様々な方式が開発されてきた。第一世代のシーケンサは，キャピラリー電気泳動に基づくシーケンシング方式を採用しており，ヒトゲノム計画の実現に多大な貢献を果たした。2004 年にヒトゲノムの全塩基配列の解読が完了すると，DNA シーケンサの開発目標はゲノムを 10 万円以下でシーケンスすることにシフトした（$1000 Genome）。2008 年に入り，超並列 Sequence by Synthesis 方式を採用する次世代シーケンサ（next generation sequencer：NGS）が登場したことで，更なる低コスト化，ハイスループット化が進んだ。図 1.1 は，アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health：NIH）が提供するヒト全ゲノムの解析コストの年次推移を示すグラフである。図中白線は，半導体微細加工技術の指標であるチャネル寸法の年次推移を表す Moore の法則に倣った線である。2008 年を境に，ゲノム解読コストは，微細化の進むスピードよりも早く低コスト化していることを表している。2015 年には一日かつ 10 万円以下でヒトゲノムが解析できるようになった[2]。多数の研究機関がこの NGS を導入したことで，疾患に関わるタンパク質に関連する遺伝子存在が多数明らかになった[3]。これにより，各人毎に適切な薬剤が異なっていることも明確になったため，DNA を解読することは研究分野を超え，医療現場においても実施されるようになった[4]。

一方で，遺伝子との相関が未解明な疾病も多々存在する。特に，関連遺伝子が長い場合や，ゲノム内の広範囲に存在する遺伝子が疾病と相関する場合など，複雑な遺伝子の変異や，構造多型に基づく疾患に多く見られる。このような疾患として，例えば，精神疾患があり，その関連遺伝子の存在する範囲が 6 千塩基と広範囲にわたる[5]。他にもパーキンソン病においては，その関連遺伝子の一つであり，糖脂質分解酵素の一つであるグルコセレブロシダーゼを発現するGBA 遺伝子に変異を有することで糖脂質代謝に異常をきたすが，その変異は 8900 塩基の範囲において各 50 塩基以上の長さで多数の複雑な構造多型を有するとされている[6-7]。これらの関連遺伝子の相対位置情報が疾患の特定には重要であるが，断片化することで情報が失われてしまう。NGS は，高スループット，低コストな解析を実現しつつあるが，原理的にDNA 一分子辺りの読取塩基長が短く，断片的に出力された情報をアセンブルすることでゲノムシーケンシングを実現している。そのため，複雑な遺伝子の変異や，構造多型に基づく疾患の解明が困難である。そこで，DNA をなるべく断片化せずに解読するシーケンシンサーが求められた。 2010 年 Pacific Bioscience（Pac Bio）社から，単分子酵素の一塩基伸長反応を検出することで，シークエンシングを実現する次々世代のシーケンサが発売された。PacBio 社の方式は，Zero Mode Waveguide（ZMW）を用いた一分子イメージングの方式を採用している。本方式では，ポリメラーゼを ZMW の底部に固定し，解析対象である環状化 されたDNA を鋳型に伸長反応させる。ここで，酵素により取り込まれるデオキシヌク レオチド三リン酸（deoxyribonucleotides : dNTPs）には蛍光標識がされている。酵素 の伸長反応によって一分子の dNTP が取り込まれる際，waveguide 内に滞在する対象 dNTP の時定数が長くなり，その蛍光のみが観察される。鋳型の並びに応じて相補的に 取り込まれる各 dNTP の蛍光波長の変化から，対象となる DNA のシークエンシングを 実現する[9]。複数の酵素の伸長反応過程の平均として出力される情報から配列決定を するのではなく，一分子ずつの伸長反応によって出力された情報を直接検出することで，解析可能塩基長を各段に長くした。これまでのシーケンサの最大読取塩基長が千塩基程 度（キャピラリー型シーケンサ）であるのに対し，PacBio 社の方式は，長い鋳型 DNA 及びより長く伸長反応を可能とするポリメラーゼを用意することで，DNA 一分子辺り の読取塩基長を約 8 千塩基まで伸ばした。

単分子シークエンシングによるDNA 一分子辺りの読取塩基長は，ラベルフリーを実 現することで，更に長鎖化してきた。ラベルフリーの DNA シーケンシング法（直接読 取 DNA シーケンサ）としてはいくつかアイディアが上がっているが[10-12]，商用化さ れ，最も利用されているシーケンサがナノポアを用いたシーケンシング方式である[13]。 1989 年にDavid Deamer 博士によって編み出された，チャネルタンパクを用いて DNA の塩基配列をシーケンシングするというアイディアが発端である(図 1.2)。このナノポ アを用いた DNA シークエンシングのアイディアは 23 年後に実現した[13]。

図 1.3 はナノポアシーケンシング方式の原理を示す。電解質溶液を含む液槽（チャンバ）はナノポアを有する薄膜によって二つに分割される（cis / trans チャンバ）。分割されたチャンバにはそれぞれ銀塩化銀電極が配置され，両チャンバ間に電位差を生じさせると，ナノポアの径に応じたイオン電流が計測される。読取対象の DNA は，cis チャンバに導入する。trans チャンバが高電位になるよう電圧を印加すると，DNA は骨格を構成するリン酸基により溶液中で負に帯電しているため，cis チャンバから transチャンバにナノポアを通して電気泳動によって誘導される。この時，計測されていたイオン電流が減少し，この電流の減少量（封鎖電流量）は，DNA を構成する塩基種に応じて変化する。この変化量を塩基配列に変換することで DNA シーケンシングを実現する。このように，シーケンシングに際して蛍光標識を必要としないことから，更なるコスト低減が期待される。また，酵素反応等の読取長を制限する要素が存在しないため，原理的にこれまでの技術以上に長く読むことが可能となる。加えて，これまで RNA や，修飾 DNA の解析などには 4 種の塩基に変換した上でシーケンシングが行われており，変換効率の低さなどから本来の情報が失われる懸念があったが，本手法では解析対象のサンプルを直接解読するため，これらの懸念も排除可能となることが期待される。

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参考文献

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