食虫哺乳類由来神経毒ペプチドの生物有機化学的研究

概要

報告番号

※

第

主

論文題目
氏

名

号

論

文

の

要

旨

食虫哺乳類由来神経毒ペプチドの生物有機化学的研究

矢野

佑介

論 文 内 容 の 要 旨
本 論 文 は 食 虫 哺 乳 類 ブ ラ リ ナ ト ガ リ ネ ズ ミ の 顎 下 腺 由 来 の 神 経 毒 ペ プ チ ド Blarina
Paralytic Peptides (BPPs) 1, 2 に 関 す る 研 究 に つ い て 述 べ た も の で あ る ． こ れ ま で 研 究
されてきた動物毒は，爬虫類や海洋生物由来のものが多い．一方で哺乳類由来の毒は
そもそも有毒とされる種が少ないことや，それらの種が調査困難な環境に生息してい
るといった理由から研究はあまり進展していない．哺乳類の中でもごく限られた種の
みが毒を生産・保有する理由は分かっていないことに加えて，哺乳類由来の毒にはそ
の種の生態に関わる特異な機能が備わっている可能性も予想されることから非常に魅
力 的 な 研 究 対 象 で あ る と 言 え る ．そ こ で 本 研 究 で は BPP 類 の 合 成 と 生 物 活 性 評 価 を 実
施 し ， BPP 類 の 構 造 を 決 定 す る と と も に 新 た な 機 能 を 見 出 す こ と を 目 的 と し た ．
第 1 章では主に哺乳類由来の毒に関する過去の研究について述べた後，本研究で取
り 扱 う ブ ラ リ ナ ト ガ リ ネ ズ ミ (Blarina brevicauda) と BPP 類 に つ い て 詳 述 し た ． ト ガ
リネズミは真無盲腸目に属する食虫動物であり，昆虫やミミズなどの無脊椎動物を主
な 餌 と す る ． し か し 北 米 に 生 息 す る ブ ラ リ ナ ト ガ リ ネ ズ ミ は 体 長 約 7~10 cm と ト ガ リ
ネズミの中では比較的大型の種であり，無脊椎動物だけでなくカエルやネズミなどの
脊椎動物も襲って捕食する習性が知られている．過去の研究において，ブラリナトガ
リ ネ ズ ミ の 顎 下 腺 抽 出 物 か ら 脊 椎 動 物 に 対 す る 致 死 性 プ ロ テ ア ー ゼ 毒 blarina toxin が
単離されていたが，この動物が主な餌とする無脊椎動物に対する麻痺性神経毒につい
ては未解明であった．そこでブラリナトガリネズミの顎下腺抽出物について分離精製
が 行 わ れ た 結 果 ， ミ ー ル ワ ー ム 麻 痺 活 性 を 示 す 分 子 量 約 5.2 – 5.6 kDa の 2 種 類 の ペ プ
チ ド BPP 1, 2 が 発 見 さ れ た ． BPP 類 の 構 造 は そ れ ぞ れ 48, 53 ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な り ，
分子内に 3 組のジスルフィド結合を含む一本鎖ペプチドであると決定された．しかし
野 生 の ト ガ リ ネ ズ ミ か ら 得 ら れ た BPP 類 の 量 は 少 な く ，ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 を 含 む
立体構造の解析や詳細な生物活性評価はされていなかった．そこで著者は推定された

構 造 の BPP 類 を 化 学 合 成 し ， そ の 構 造 決 定 と 生 物 活 性 試 験 を 実 施 す る こ と と し た ．
第 2 章 で は ， BPP2 の 化 学 合 成 な ら び に BPP 類 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 訂 正 に つ い て 述 べ
た ． BPP 類 の ア ミ ノ 酸 配 列 は 哺 乳 類 に お い て 広 く 保 存 さ れ て い る オ ピ オ イ ド 前 駆 体 タ
ン パ ク 質 proenkephalin の 一 部 に あ た る synenkephalin (SYN) と 類 似 し て い る ． SYN は
分 子 内 に 3 組 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 含 み ， そ の 結 合 様 式 は Cys(I)–Cys(IV), Cys(II)–
Cys(V), Cys(III)–Cys(VI) (Type–I 構 造 と 呼 ぶ ) と 過 去 に 決 定 さ れ て い る ． 一 般 に ア ミ ノ
酸配列が類似しているペプチド同士はその高次構造も似ていると考えられるため，
SYN と BPP 類 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 は 同 一 で あ る と 予 想 し ， ま ず は Type–I 構 造 の
BPP2 を 合 成 す る こ と と し た ．は じ め に Fmoc 固 相 合 成 法 お よ び native chemical ligation
(NCL) 法 に よ り ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 対 と な る Cys 残 基 が そ れ ぞ れ Acm 基 と tBu 基 で
保 護 さ れ た BPP2 の 一 本 鎖 ペ プ チ ド を 得 た ． 続 い て 保 護 基 の 除 去 と ジ ス ル フ ィ ド 結 合
形 成 を 段 階 的 か つ 選 択 的 に 行 い Type–I 構 造 の BPP2 を 合 成 し た ． し か し こ の 合 成 品
BPP2 の HPLC 保 持 時 間 や UV ス ペ ク ト ル の 吸 収 パ タ ー ン は 天 然 品 BPP2 の も の と は 一
致 し な か っ た ． こ の こ と か ら 当 初 決 定 し た BPP2 の ア ミ ノ 酸 配 列 や ジ ス ル フ ィ ド 結 合
様式が誤っていることが示唆された．そこで，最近報告されたブラリナトガリネズミ
顎 下 腺 の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 解 析 情 報 に 基 づ い て BPP 類 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 精 査 し
た ．そ の 結 果 ，当 初 決 定 さ れ た BPP 類 の ア ミ ノ 酸 配 列 に お け る 3 残 基 の 誤 り を 発 見 し ，
BPP1, 2 の 全 長 ア ミ ノ 酸 配 列 を そ れ ぞ れ 47, 52 残 基 へ と 訂 正 す る に 至 っ た ．
第 3 章 で は ， ア ミ ノ 酸 配 列 訂 正 後 の BPP2 の 合 成 と そ の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 の 解
析 に つ い て 述 べ た ． 合 成 に 先 立 ち ， 訂 正 し た ア ミ ノ 酸 配 列 に 基 づ い て BPP2 の 立 体 構
造 を 予 測 す べ く ColabFold を 使 用 し た ． そ の 結 果 ， こ れ ま で 推 定 し て い た Type–I 構 造
と は 異 な る Cys(I)–Cys(V), Cys(II)–Cys(IV), Cys(III)–Cys(VI) と い う 新 た な ジ ス ル フ ィ
ド 結 合 様 式 (Type–II 構 造 と 呼 ぶ ) を 持 つ も の が 最 適 な 予 測 構 造 と し て 得 ら れ た ．以 上
の 結 果 か ら Type–I 構 造 と Type–II 構 造 の 両 方 の 可 能 性 を 踏 ま え て BPP2 の 合 成 を 行 っ
た ．全 て の Cys 残 基 が 無 保 護 の 状 態 の 一 本 鎖 ペ プ チ ド を Fmoc 固 相 合 成 法 と NCL 法 に
よ り 合 成 し ， 酸 化 還 元 剤 と し て cystine / cysteine を 用 い た 酸 化 還 元 平 衡 条 件 下 で フ ォ
ー ル デ ィ ン グ を 行 っ た 結 果 ，BPP2 が ほ ぼ 単 一 の 生 成 物 と し て 得 ら れ た ．こ の 合 成 品 の
HPLC 保 持 時 間 と UV ス ペ ク ト ル の 吸 収 パ タ ー ン は 天 然 品 BPP2 の も の と よ く 一 致 し
た ．な お 合 成 品 BPP2 の CD ス ペ ク ト ル の 波 形 は ，上 記 の 立 体 構 造 モ デ ル か ら 予 想 し た
波 形 と ほ ぼ 一 致 し て い た ．次 に ，ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 を 決 定 す る た め 合 成 品 BPP2 を
TCEP 処 理 で 部 分 的 に 還 元 し ， 2 種 類 の ア ル キ ル 化 剤 (NEM, IAM) で 段 階 的 に S-ア ル
キ ル 化 し た ． 得 ら れ た 複 数 の 修 飾 ペ プ チ ド を HPLC で 分 離 後 ， そ れ ぞ れ を 酵 素 消 化 し
て 得 た 断 片 ペ プ チ ド を MALDI MS/MS で 網 羅 的 に 解 析 し た ． そ の 結 果 ， 合 成 品 BPP2
の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 は Type–II 構 造 と 判 明 し ， 天 然 品 BPP1, 2 の ジ ス ル フ ィ ド 結
合 様 式 も Type–II 構 造 で あ る と 決 定 で き た ．
第 4 章 で は ， 合 成 品 を 用 い た BPP2 の 生 物 活 性 評 価 に つ い て 述 べ た ． 合 成 品 BPP2
(5.6 µg / g body weight) を ミ ー ル ワ ー ム に 腹 腔 内 投 与 す る と 投 与 直 後 か ら 数 分 で 全 身
に 麻 痺 が 広 が り ，1.5 時 間 後 に は 外 部 刺 激 に 対 す る 応 答 が 見 ら れ な く な っ た ．こ の 麻 痺

効 果 は 6 時 間 程 度 持 続 し た ． ま た ホ ー ル セ ル パ ッ チ ク ラ ン プ 法 を 用 い て BPP2 に 対 す
る Ca チ ャ ネ ル の 応 答 評 価 を 行 っ た ．そ の 結 果 ，BPP2 (0.84 µM) は ヒ ト T 型 Ca チ ャ ネ
ル (hCa v 3.2) を 活 性 化 し ， そ の 活 性 化 閾 値 を 11 mV 低 下 さ せ る こ と が 分 か っ た ． こ れ
は膜電位の変化に対するチャネルの感度が高まっていることを意味する．一方で痛覚
の 伝 達 に 関 与 す る ヒ ト N 型 Ca チ ャ ネ ル (hCa v 2.2) に 対 し て は ，BPP2 は 顕 著 な 効 果 を
示 さ な か っ た ．hCa v 3.2 を 活 性 化 し て チ ャ ネ ル の 感 度 を 向 上 さ せ る 化 合 物 は こ れ ま で に
報 告 が な く ， 今 回 見 出 し た BPP2 の 活 性 は 新 規 性 が 高 い と 言 え る ． さ ら に 立 体 構 造 比
較 プ ロ グ ラ ム DALI を 用 い た 解 析 か ら ，BPP2 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 と 立 体 構 造 は ム
カ デ 由 来 の 神 経 毒 ペ プ チ ド scoloptoxin (SLPTX) 類 と 高 い 類 似 性 を 示 す こ と も 発 見 し
た 。 SLPTX 類 は Na チ ャ ネ ル や K チ ャ ネ ル に 対 す る 特 異 的 な 阻 害 活 性 や ， 昆 虫 に 対 す
る 致 死 活 性 を 示 す ．ま た SLPTX 類 は 節 足 動 物 に お い て 広 く 保 存 さ れ て い る 無 毒 の 内 因
性ペプチドと共通の起源を持つことが知られている．このことは互いにアミノ酸配列
が 類 似 し て い る BPP 類 と SYN に も 当 て は ま る 可 能 性 が あ る ．つ ま り BPP 類 が SYN を
起源とした分子進化を経て毒性を獲得したとすれば，イオンチャネルを標的とする点
や 類 似 の 立 体 構 造 を 持 つ 点 で 共 通 す る BPP 類 と SLPTX 類 は ， そ れ ぞ れ の 種 の 生 存 戦
略にとって有利に働くような進化が内因性ペプチドに起きた結果生み出されたと推察
される．
以上より，本研究ではブラリナトガリネズミの顎下腺から単離された神経毒ペプチ
ド BPP 類 の ア ミ ノ 酸 配 列 と ジ ス ル フ ィ ド 結 合 様 式 を 決 定 し ， さ ら に BPP2 の 全 合 成 を
達 成 し て そ の 生 物 活 性 を 明 ら か に し た ．希 少 な 哺 乳 類 由 来 の 毒 で あ る BPP 類 に 関 す る
本研究で得られた知見は，動物毒の多様性や生物進化における毒の関わりの観点から
も高い意義があり，哺乳類毒に関する今後の研究の発展にも寄与すると期待される．

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