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Analysis of Polyunsaturated Fatty Acids by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Zhu, Huibin 大阪大学 DOI:10.18910/93021

2023.09.25

概要

Title

Analysis of Polyunsaturated Fatty Acids by
Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Author(s)

Zhu, Huibin

Citation

大阪大学, 2023, 博士論文

Version Type VoR
URL

https://doi.org/10.18910/93021

rights
Note

Osaka University Knowledge Archive : OUKA
https://ir.library.osaka-u.ac.jp/
Osaka University

様式3




論文題名

















慧 彬




Analysis of Polyunsaturated Fatty Acids by Electrospray Ionization Mass Spectrometry
(エレクトロスプレーイオン化質量分析法による多価不飽和脂肪酸の解析)

論文内容の要旨
生体内に存在するアラキドン酸やドコサヘキサエン酸の代謝産物が高い生理活性を持つ脂質で、
HETEs、HDoHEs、Lipoxins、Resolvins等に分類されて、多くは抗炎症作用がある。それらを分離して検
出する方法は多く報告されているが、これらの多価不飽和脂肪酸(PUFA)は不飽和二重結合を多く含む
ため分解されやすく、また、構造が類似し、異性体が多数存在するため、それらを確実に同定、定量す
ることは難しい。特に、生体試料に含まれるPUFA類の測定では、試料の前処理等の工夫を行っても低分
子の夾雑物が多いため、より困難ことが多い。

Figure 1. HETE、HDoHE類の構造

近年、化学誘導化剤を用いて脂肪酸を誘導化し、液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC-MS)で
検出、比較定量する方法が報告されている。しかし、それらの構造異性体の分離、検出は難しく、目標
とする脂肪酸類の性質に合わせて分離効果を最適化できるような新規な誘導化剤の開発が必要であると
考え、誘導化剤として新たに短鎖ペプチドを用いる方法を試みた。この方法の利点としては、1)脂肪
酸はペプチドのN末端に簡単に結合できる。2)任意のアミノ酸配列を設計することで、疎水性・親水性
の調整や質量分析での測定感度を向上させることができる。3)任意の数および種類の安定同位体
(13C、15N)を導入することができる⇒内部標準物質としての利用、複数の試料間での比較定量解析が可
能。

Figure 2. HETE及び HDoHE 類の3種類のペプチドによる誘導化後のLCによる分離比較(左)と2人の血清を用いた比較定量分
析(右)。Serum BはPro (13C5,

15

N)を含ペプチドで標識。

以上に基づいて、ここでは3種類のペプチド(Arg-Pro-Phe3-Arg-NH2、Arg-Pro-Phe-Arg-NH2、Arg-ProGly6-Arg-NH2)を調製し、それらを用いてHETE及び HDoHE 類の誘導化を行って、分離効果と異なる
検体間での比較解析について検討した。血清を用いた分離能を試験した結果、HETEおよび HDoHEの
場合、Arg-Pro-Phe-Arg-NH2が良好な分離を示すことがわかった(Fig. 2左)。また、安定同位体標識Pro
を導入したペプチドを誘導化剤として用いることにより、異なる2つの検体に対して一度の分析で比較
解析が可能であることを示した(Fig. 2右)。
レゾルビン(RvD, RvE)、マレシン(Mar)、リポキシン(Lx)類は、抗炎症や、ヒトT細胞反応の
制御やヒトの免疫機能の改善に重要な役割を果たしている。しかし、これらの物質の検出方法に関する
研究は少ない。本研究では、全てのPUFA類の中でアリル位に隣接ジオール基を持つRvD1、 RvD2、
RvD4、RvE3、LxA4、LxB4、Mar2 (Figure 3A)に対して、誘導化後のMS/MSにおいて、アリル位に隣接す
るジオール基間で観測される断片化を見出した。(Figure 3B, 3C)

(A)

m/z
213.2

(B)

(C)

m/z
329.3

Resolvin E3-DMED

Resolvin D1-DMED

Figure 3. DMED化されたRvE3及びRvD1の構造 (A)、及び、MS/MSにおいてアリル位に隣接ジオール基間で観測される開裂と観
測されるフラグメントイオン(B, C)。

アリル性水酸基が、末端DMED部分に対して遠位にある場合(RvD1、RvD4、LxA4)、アルデヒド (CH=O) タイプのイオンが観察され(Fig. 3B)、DMED側にある場合(RvD2、RvE3、LxB4、Mar2)、アリル
カルベン (-CH=CH-CH:) タイプのフラグメントイオンが観察される(Fig. 3C)。
これら7種のPUFAで特徴的に観測されるフラグメントイオンを基に、定量測定のための検量線を
UPLC/ESI-MS/MS(multiple-reaction monitoring (MRM)法)を用いて作成し、それをヒト血清中のPUFA
の定量に応用した。通常の測定では、これらのPUFAの検出には脱水によるフラグメントイオンが用いら
れるため、同じ質量をもつ異性体の区別はしばしば困難であるが、上記の特徴的なフラグメントイオン
を用いることにより、ヒト血清中(市販されている健康なボランティア 8人(20~36 歳)の血清)全てに
おいて、LxA4、LxB4、RvD1が、一部の検体でそれら3種に加えてRvD2、RvE3R、RvE3Sが観測された。本
分析では血清20μLという微量試料からの測定が可能であることを示すことができ、本方法は、試料の
前処理が容 易かつ実行的であるのみならず、限られた量の臨床サンプルや生体から得られたサンプル
に適用できるものと考えられる。

様式 7

論文審査の結果の要旨及び担当者








(職)

論文審査担当者

慧 彬







主 査

教授

高尾

敏文

副 査

教授

村田

道雄

副 査

教授

鈴木

孝禎

論文審査の結果の要旨
生体内に存在する多価不飽和脂肪酸(PUFA)の代謝産物は高い生理活性を持つ脂質である。
その中で、 HETEs、HDoHEs、Lipoxins、Resolvins 等に分類されるものの多くは抗炎症作用が
あり、それらの分離、定量は生理機能を知るうえで重要である。しかし、PUFA は不飽和二重結
合を多く含むので分解されやすく、また、構造が類似し、異性体が多数存在するため、それら
を確実に定量することは難しい。近年、化学誘導化剤を用いて脂肪酸を誘導化し、液体クロマ
トグラフィー/質量分析法(LC-MS)で検出、定量する方法が数多く報告されている。しかし、
誘導化後の PUFA においても分離、検出は尚難しい。本研究は、PUFA 類の性質に合わせて LC で
の分離能を調整でき、さらに、MS で高感度で検出できる新規な誘導化剤を開発することを目的
としている。本論文では、誘導化剤として、新たに短鎖ペプチドを考案し、次の 3 つの利点と
効果について示している。1)脂肪酸 はペプチドの N 末端に簡単に結合できる。2)任意のア
ミノ酸配列を設計することで、疎水性・親水性の調整や質量分析での測定感度を向上させるこ
とができる。3)任意の数および種類の安定同位体 (13 C、 15N)を構成アミノ酸に導入することが
できる⇒内部標準物質としての利用や複数の試料間での比較定量解析に応用できる。種々の短
鎖ペプチドの中で、Arg-Pro-Phe-Arg-NH 2 を誘導化剤として用いた場合、HETE 及び HDoHE 類の
LC での分離が良好であること、また、安定同位体標識 Pro を導入した同じペプチドを誘導化剤
として用いて、2 人のヒト血清間で HETE 及び HDCE 類の比較解析が一回の分析で行えることを
示している。(第一章)このような比較解析を PUFA の分析で初めて示した結果と評価される。
レゾルビン(RvD, RvE)、マレシン(Mar)、リポキシン(Lx)類は、抗炎症や、ヒト T 細胞
反応の制御やヒトの免疫機能の改善に重要な役割を果たしている。第二章では、アリル位に隣
接ジオール基を持つ RvD1、RvD2、RvD4、RvE3、LxA4、LxB4、Mar2 に対して、誘導化後の MS/MS
において特徴的に観測される断片化を見出してる。すなわち、アリル性水酸基が、末端の誘導
化剤部分に対して遠位にある場合(RvD1、RvD4、LxA4 において)、アルデヒド(-CH=O)タイプの
イオンが観察され、それに対して、誘導化剤側にある場合(RvD2、RvE3、LxB4、Mar2 におい
て)、アリルカルベン(-CH=CH-CH:)タイプの断片イオンが観察されることを見出している。こ
れら 7 種の PUFA に対して特徴的に観測される断片イオンは、各 PUFA の MS/MS における同定確
度の向上につながる。第 3 章では、この断片イオンの情報を基に測定パラメーターを作成し、
ヒト血清中の PUFA の定量解析に応用している。その結果、ヒト血清中(市販のボランティア 8
人)全てにおいて LxA4、LxB4、RvD1 が、一部の検体でそれらに加えて RvD2、RvE3 が観測され
た。また、本分析は血清 20μL という微量試料からの測定が可能であることも示している。
以上のように,本論文は生理活性をもつ PUFA 類の高感度分析のための方法として有用であるのみ
ならず、実際の臨床検体に応用可能であることを示しており、理学、医学に寄与するところが大き
い。よって、本論文は博士(理学)の学位論文として十分価値あるものと認める。

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Acknowledgements

I would like to express my sincerest gratitude to Professor Toshifumi Takao, who

always gives me not only a great number of invaluable suggestions and feedback

through this work, but also huge unwavering support and heartfelt encouragement

throughout my academic journey. I am genuinely grateful for the knowledge and skills

I have gained under his mentorship. The whole work was carried out under his

supervision in Laboratory of Protein profiling and functional proteomics at Institute for

Protein Research, Osaka University.

I would like to express my gratitude to Professor Masayuki Inoue from Laboratory

of Synthetic Natural Products Chemistry at Graduate School of Pharmaceutical

Sciences, The University of Tokyo for providing the precious Resolvin E3 standards.

I would like to express my gratitude to Professor Michio Murata from Laboratory

for Biomolecular Chemistry at Graduate School of Science, Osaka University for the

valuable suggestions and fruitful discussions.

I would like to also express my gratitude to Professor Takayoshi Suzuki from

Department of Complex Molecular Chemistry at Institute of Scientific and Industrial

Research, Osaka University for the valuable suggestions and discussions.

I would like to express my special thanks to Mone Kurokawa and Mengyao Chen,

the members of Takao Lab who gave me so many helps on this work.

I am grateful to the financial support from Protein Research Foundation.

I am grateful to Hiroto Akiya and Ko Kanegae, the artists whose stages encouraged

me throughout my academic life.

Finally, I am grateful to my parents for their understanding, encouragement and

support on this study, especially my mother Caiqin Gu, who is not only a great woman

but also a respectable professor from The School of Chemistry and Chemical

Engineering, Guangzhou University.

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