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ラットにおける12α水酸化胆汁酸による肝脂質蓄積と血圧上昇との関連に関する研究

下田, 智子 北海道大学

2023.03.23

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ラットにおける12α水酸化胆汁酸による肝脂質蓄積と血圧上昇との関連に関する研究

下田, 智子

北海道大学. 博士(農学) 甲第15290号

2023-03-23

10.14943/doctoral.k15290

http://hdl.handle.net/2115/89414

theses (doctoral)

Shimoda_Tomoko.pdf

Instructions for use

Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP

ラットにおける 12α 水酸化胆汁酸による
肝脂質蓄積と血圧上昇との関連に関する研究

北海道大学 大学院農学院
応用生物科学専攻 博士後期課程
下田

智子

1

目次
目次

2

略語一覧

4

図リスト

6

表リスト

7

序論

8

第1章

Wistar ラットと WKAH ラットにおける肝脂質蓄積の変動係数評価

15

1-1.

背景と目的

16

1-2.

実験材料および実験方法

18

1-2-1.

実験動物および食餌

18

1-2-2.

血漿トランスアミナーゼおよび肝脂質の測定

18

1-2-3.

変動係数の解析

19

1-2-4.

統計解析

19

1-3.

結果

1-3-1.

近交系と非近交系ラットにおける血漿トランスアミナーゼおよび肝脂質の
変動係数の比較

1-3-2.
1-4.
第2章

20

肝脂質パラメーターと変動係数との相関

考察
コール酸添加食摂取ラットにおける肝脂質蓄積は血圧上昇を伴う

20
20
25
27

2-1.

背景と目的

28

2-2.

実験材料および実験方法

29

2

2-2-1.

実験動物および食餌

29

2-2-2.

血圧測定

30

2-2-3.

血漿,組織および糞尿の回収

30

2-2-4.

胆汁酸解析

31

2-2-5.

血漿,肝臓,尿中の生化学的指標の測定

31

2-2-6.

肝臓中の酸化コレステロールの解析

32

2-2-7.

肝臓,腎皮質中のアンジオテンシノーゲン発現遺伝子の測定

33

2-2-8.

統計解析

33

2-3.

結果

36

2-3-1.

食餌摂取量および体重・臓器重量・血圧の評価

36

2-3-2.

血圧の経時的変化と血圧に関連するパラメーター

36

2-3-3.

胆汁酸組成の解析

37

2-3-4.

12α 水酸化胆汁酸と血圧との相関

37

2-3-5.

酸化コレステロールと血圧との相関

37

2-4.

考察

44

総括

48

引用文献

55

参考論文

67

国内学会

68

謝辞

69

3

略語一覧
ACC

Acetyl-CoA carboxylase

ALT

Alanine aminotransferase

ASBT

Apical sodium-dependent bile acid transporter

BA

Bile acid

BP

Blood pressure

CA

Cholic acid

CDCA

Chenodeoxycholic acid

Chol

Cholesterol

CV

Coefficient of variation

CYP3A2

Cytochrome P450 family 3 subfamily A member 2

CYP7A1

Cholesterol 7α-hydroxylase

CYP8B1

Sterol 12α-hydroxylase

DBP

Diastolic blood pressure

DCA

Deoxycholic acid

DNL

de novo Lipogenesis

FASN

Fatty acid synthase

FFA

Free fatty acid

FXR

Farnesoid X receptor

GLUT

Glucose transporter

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

MAFLD

Metabolic dysfunction associated fatty liver disease

NAFLD

Non-alcoholic fatty liver disease

NCD

Non-communicational disease

LXR

Liver X receptor alpha

OGTT

Oral glucose tolerance test

PXR

Pregnane X receptor

RAAS

Renin angiotensin aldosterone system

SBP

Systolic blood pressure

SREBF1

Sterol regulatory element binding transcription factor 1

TCA

Taurocholic acid

4

TG

Triglyceride

TNF-α

Tumor necrosis factor-alpha

VLDL

Very-low-density lipoprotein

5

図リスト
序章
Figure S-1. Schematic diagram of hepatic lipid accumulation and increased blood pressure in previous
studies
第1章
Figure 1-1. Experimental design for CV analysis
Figure 1-2. Comparison of CVs of several parameters in inbred rats and outbred stocks
Figure 1-3. Correlation between the CVs of parameters determined
第2章
Figure 2-1. Parameters in relation to blood pressure (BP) and the polyol pathway
Figure 2-2. BA composition in rats fed a control or CA diet for 13 weeks
Figure 2-3. Correlation between 12αOH BA and BP.
Figure 2-4. Pearson’s correlations between oxysterols and blood pressure (BP)
総括
Figure S-2. Schematic diagram of hepatic lipid accumulation and increased blood pressure.

6

表リスト
第1章
Table 1-1. Multivariate correlations of CVs in the parameters among inbred and outbred stocks
第2章
Table 2-1. Diet compositions in control and CA diet
Table 2-2. BAs measured in this study
Table 2-3. Biochemical parameters
Table 2-4. Hepatic oxysterol concentrations

7

序論

8

日本は世界において長寿国であるが (Brown, 2015),平均寿命が長いことは必ずしも生活の
質が高いとは限らない.平均寿命が長くなると,死亡までに病気や障害のリスクが高まる可能性が
ある (Brown, 2015).健康寿命は,健康上の問題による日常生活活動の制限を特徴としない人の寿命
の長さとして定義される (WHO, 2000).平均余命と健康寿命の差は,健康状態が悪い状態で生きた
平均年数を示すため,単に平均寿命を延ばすだけでなく,健康寿命を延ばすことこそが重要であ
る.世界保健機関 (WHO) によると,非感染性疾患 (non-communicational disease, NCD) は「不健康な
食事や運動不足,喫煙,過度の飲酒,大気汚染などにより引き起こされる,癌・糖尿病・循環器疾
患・呼吸器疾患・メンタルヘルスをはじめとする慢性疾患をまとめて総称したもの」と定義されて
いる (Alwan, 2011).2022 年に策定されたアクションプランでは,肥満の予防と管理のための新たな
勧告がなされ,2025 年までに 5 歳以下の子どもや青年,成人の肥満の増加を止め,2030 年までに
あらゆる形態の栄養不良をなくすために肥満の予防と管理に関するライフコースの一連に関連する
目標が示された (Ghebreyesus, 2022).このように,近年あらゆる形態の栄養不良への取り組みが強
調されている.食事や代謝異常に関連した疾病が発症する前段階での予防や疾病の発症を未然に防
ぐための代謝機構の解明は重要である.
非アルコール性脂肪性肝疾患 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) (Eslam, et al., 2020) の
罹患率は世界的に急激に増加している (Younossi, 2016; Li, 2019).NAFLD による肝脂質蓄積は,生
検による組織学的解析により鑑別される.特に,肝線維化の進展は NAFLD 患者において心疾患や
肝関連死を含む,長期転帰の主な予測因子として認識されている (Dulai, 2017).また,アディポネ
クチン (Arita, et al., 1999) や TNF-α (Yamauchi, et al., 2002) がインスリン抵抗性を惹起することによ
る脂肪組織での脂質蓄積が報告されている.このように肝線維化の進展過程や肥満にともなう脂肪
細胞での脂質蓄積の要因は解明され始めているが,その全ての機序が解明されているわけではな
い.2020 年,脂肪肝が代謝異常により引き起こされることを明確にした代謝異常関連脂肪肝疾患

9

(metabolic dysfunction associated fatty liver disease, MAFLD) という概念が提唱された (Eslam, et al.,
2020).多くの交絡因子が関与する肝臓での脂質代謝はいまだ不明な点が多い.最近のシステマテ
ィックレビュー (Ye, et al., 2020) では脂肪肝の4割は非肥満であるとされることから,肥満によらな
い代謝異常も無視できず,それに関連する代謝物の解析は脂肪肝発症の予防に重要な役割を果たす
と考えられる.
脂質代謝において重要な役割を担う物質のひとつに胆汁酸がある (Figure S-1).胆汁酸はコ
レステロールから肝臓で合成される両親媒性化合物であり (Bloch, et al., 1943),コレステロールの異
化産物として広く認識されている (Schwarz, et al., 1996).胆汁酸の合成において主要な段階は,コレ
ステロールの 7α 水酸化反応である (Myant & Mitropoulos, 1977).ラットでは,門脈から離れた部位
でコレステロール 7α 水酸化酵素 (cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1) が高発現し (Ugele, et al.,
1991),それにより生成された 7α 水酸化コレステロールが 12α 水酸化酵素 (sterol 12α-hydroxylase,
CYP8B1) によりステロイド骨格の 12 位での水酸化反応 (Pandak, et al., 2001) を受けるか否かによっ
て 12α 水酸化胆汁酸もしくは非 12 水酸化胆汁酸に分類される.脂質の吸収においては食事由来脂
質の可溶化が律速となるため (Hofmann & Mysels, 1988),肝臓から胆管を通って小腸に分泌された
胆汁酸は脂質の消化・吸収の促進に寄与する.胆汁酸は,ステロイド骨格を基本とした頑健な構造
を持つことに加え,回腸に高発現する頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体 (apical sodiumdependent bile acid transporter, ASBT) による能動輸送を介して門脈血中を通って再び肝臓へと戻り再
利用される (Chiang, 2009).このような胆汁酸の腸肝循環は,コレステロールの消費を最小限に抑え
ながら効率的に脂質の吸収を促進するという,エネルギー確保のための巧妙なシステムと考えるこ
とができる.これまで,高脂肪食がラットの 12α 水酸化胆汁酸の分泌を増加させ,その糞便排泄は
エネルギー摂取量に依存すること (Yoshitsugu, et al., 2019),肝臓や門脈および糞中の 12α 水酸化胆
汁酸濃度と肝臓脂質蓄積との間では有意な正の相関を示すことが見出された (Hori, et al., 2020).こ

10

の時の体内胆汁酸環境を模倣するため,12α 水酸化一次胆汁酸であるコール酸 (CA) を,腸内細菌に
よる胆汁酸の 7α 脱水酸化が滞りなく進む程度に含む飼料 (0.5 g CA /kg 飼料) をラットに与えること
で,コントロール食とほぼ同等の食餌中エネルギー組成を保ちつつ高脂肪食摂取時に観察される
12α 水酸化胆汁酸の特異的な増加を模倣する取り組みが行われた (Islam, et al., 2011; Lee, et al.,
2020).高脂肪食を摂取すると観察される胆汁酸代謝,すなわち 12α 水酸化一次胆汁酸やその腸内細
菌代謝物であるデオキシコール酸 (DCA)の増加が (Ridlon, et al., 2006),CA 添加食 (0.5 g CA /kg 飼
料) 摂取ラットにおいても誘導されることが確認された (Islam, et al., 2011).この条件下で十数週間
以上飼育したラットは,肥満をともなわない肝臓への脂質蓄積 (Figure S-1),血漿トランスアミナー
ゼ活性の増加,血漿アディポネクチン濃度の低下,消化管における物質透過性の亢進など,非感染
性疾患で観察されるさまざまな症状を示した (Lee, et al., 2020).この状態は,体重増加を伴わずに
肝臓に脂質が蓄積するという特徴があり,MAFLD の発症における 12α 水酸化胆汁酸の増加を反映
する状態にあるものと考えられる (Caussy, 2019; Nimer, 2021).
MAFLD は,脂肪肝に①過体重・肥満,②2 型糖尿病,もしくは③痩せ・正常体重で2項目
以上の代謝異常 (高血圧,内臓脂肪蓄積,耐糖能異常,耐脂質異常症) のいずれかを合併する場合に
診断される (Eslam et al., 2020).糖尿病治療の臨床試験 (Ueki, et al., 2012) では,高血糖の是正のみで
は脳や心血管疾患の予防は難しく,厳格な血圧や脂質レベルのコントロールを必要とすることが示
唆されている.血圧は,心拍出量と末梢血管抵抗の積で規定され,その調節機構には主に中枢・交
感神経系やホルモン,末梢血管,体液量の4つが関与する.1つめの中枢・交感神経系は,心拍出
量と末梢血管抵抗を調節することにより血圧を調整する (Kumagai, 2012).2つめの血圧調整に関与
する主要なホルモンは,カテコラミン (副腎髄質ホルモン)とレニン-アンジオテンシン-アルドス
テロン系 (renin angiotensin aldosterone system, RAAS) があげられる.副腎髄質ホルモンとしては,ア
ドレナリン (α および β1,β2 受容体に作用) とノルアドレナリン (主に α 受容体に作用) がある.交

11

感神経の刺激によって,アドレナリンは副腎髄質においてノルアドレナリンにより合成され,ノル
アドレナリンとともに血中に分泌される.これらのホルモンは受容体を介して循環器系や代謝の制
御に深く関与する.α 受容体は主に平滑筋収縮に関与しており,β1 受容体は心拍数増加および心筋
収縮力増大に,β2 受容体は血管および血管平滑筋弛緩に関与する.RAAS としては,腎臓の傍糸球
体装置から血中へ分泌されるレニンが,肝臓で産生されるアンジオテンシノーゲンを切断してアン
ジオテンシンⅠを産生する.そして,肺や血管内皮から産生されるアンジオテンシン変換酵素によ
って,アンジオテンシンⅠがアンジオテンシンⅡへと変換され,アンジオテンシンⅡ受容体を介し
て,血管平滑筋の収縮を促進する (Nishiyama, 2019).3つめの末梢血管としては,上述の交感神経
や RAAS の亢進が血管収縮を促し,末梢血管抵抗を増加させ,血圧を上昇させる.他の血管収縮因
子としては,エンドセリンやトロンボキサン A2 などがあげられ,これらの因子の増加も血管収縮
を促し血圧を上昇させる.一方,NO やプロスタサイクリンなどの主要な血管弛緩因子は,血管を
弛緩させ血圧を下降させる.また,生活習慣や加齢に伴う末梢血管抵抗の増加 (動脈硬化) も深く関
与し,動脈硬化が進展すると,血管内径が細くなり末梢血管抵抗が増加して血圧上昇を惹起する
(Moghadasian, 1999).4つめの体液量は,その恒常性を維持することが血圧を正常に保つことにつ
ながる.体液量は主に浸透圧物質によって保持される.細胞外の主要な浸透圧物質はナトリウムで
ある.ナトリウムは腎臓で尿中に排泄され,その量を適切に調節することでナトリウム量の恒常性
を維持する (Sheng, 2000).腎臓は,Figure S-1 に示すように RAAS におけるレニン-アンジオテン
シン分泌に加えて,ナトリウムや体液量調節の観点からも血圧を制御している臓器であるといえ
る.さらに,生体内のナトリウムや体液量は,腎臓に加え,肝臓や筋肉,皮膚,免疫細胞・リンパ
管系など,さまざまな多臓器が連携し合うことで恒常性が維持されていることも報告されている
(Minegishi, 2020).これまでに MAFLD で見られる脂肪肝の遷延により血圧の変動に関する機序は,

12

明らかにされていない.そこで,本研究では胆汁酸が脂質代謝だけでなく血圧に及ぼす影響に着目
した.
血圧や脂質代謝のコントロールを栄養学の視点から動物実験を用いて検討しようとする際に
は,秤量や化学分析誤差といった物理的・化学的誤差や飼育方法や環境条件などの要素によって生
ずる誤差があり,それらを克服できたとしてもなお個体差が生じ得る可能性がある.この個体差の
大きさを示す方法として,標準偏差ならびに変動係数を用いて検討することができる (Konarzewski,
et al., 1995).特に抽出や分析などのさまざまなステップにおいて生じ得る誤差をできるだけ抑えた
上で個体間変動を最小限に抑えることは,解釈し得る結果を導き出すために重要である.そこで,
本研究では,近交系と非近交系のラットにおける肝脂質関連データのバラツキの程度を評価する研
究を実施し,それをもとに選択した系統のラットを用いて CA 添加食により肥満を伴わない肝臓脂
肪蓄積が生じた際に血圧へ及ぼす影響を明らかにする事を目指した.

13

Figure S-1. Schematic diagram of hepatic lipid accumulation and increased blood pressure in previous
studies.
A conceptual diagram is shown based on previous studies.

14

第1章

Wistar ラットと WKAH ラットにおける
肝脂質蓄積の変動係数評価

15

1-1. 背景と目的
実験動物における食事誘導性の非アルコール性脂肪肝モデルとして,メチオニンやコリンの
欠乏,高脂肪食や高フルクトース食を用いたモデルがある (Ibrahim, et al., 2016).メチオニンやコリ
ンの欠乏は,肥満にはならずに肝臓で炎症や繊維化が引き起こされ,極めて重篤な肝疾患を呈する
モデルである.高脂肪食による脂肪肝症状はそれほど重篤ではないものの,脂肪組織重量の増加に
よる肥満に加え肝臓脂質蓄積と炎症が観察される (Ibrahim, et al., 2016).高フルクトース食でも肝脂
質蓄積に伴う炎症に脂肪組織重量の増加が伴う (Maithilikarpagaselvi, et al, 2016; Do, et al, 2018).
我々の用いた CA 添加飼料は 0.5 g CA /kg 飼料で 10 数週間飼育しても摂食量や体重増加に違いがな
いため (Lee, et al., 2020),肥満や炎症・繊維化を伴わずに肝臓で脂質が蓄積されるモデルである.
代謝物解析を進める中で,動物種の選択は重要な問題である.抽出や分析などのさまざまなステッ
プにおいて誤差が生じ得ることに加え,個体間での数値のバラツキも無視できない.この誤差をで
きるだけ考慮して意味のある結果を導き出すための取り組みが重要であると考える.
げっ歯類は,その遺伝的背景により近交系と非近交系に分類される (Festing, 1997).近交系
は非近交系と比べて遺伝的な均一性があり,毒性または薬理学的刺激に対する応答の表現型の個体
間変動が少なくなる (Festing, 2010).これは,近交系の使用が統計的検出力を高め,より少ない動
物で実験の再現性を向上させることを示唆している.対照的に,非近交系は実験にかかるコストが
低く,人間の集団で見られるような個体間での遺伝的浮動が想定される (Gill, 1980).生命科学に
おいて,広い分野で近交系動物が用いられているものの,近交系と非近交系の動物間の生物学的指
標の変動に関して検討している報告はほとんどない (Festing, 2014).近交系と非近交系の両方のげ
っ歯動物を使用するそれぞれの利点を考慮すると,近交系および非近交系げっ歯類動物間で,着目
すべき生化学的指標の変動を比較することは,当該研究の進捗を左右する大きな要因となりうると
考えられる.

16

そこで,第 1 章では,変動係数 (CV) を使用して,近交系と非近交系ラットの生物学的指標
として,体重,血漿トランスアミナーゼ,および肝脂質濃度の変動を明らかにすることを目的とし
た.

17

1-2. 実験材料および実験方法
1-2-1. ...

この論文で使われている画像

参考文献

55

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国内学会

下田智子,清水英寿,加茂佳恵,多田幸司,花井健人,堀将太,田中愛建,佐藤匡央,石塚敏

ットにおけるコール酸摂取による肝脂質蓄積の増加は血圧の上昇を伴う,日本栄養·食糧学会北海

道支部大会 (2022 年,札幌,口頭発表)

68

謝辞

本論文は数多くの方々の御協力を賜り,作製されたものです.私は,博士後期課程から本研究室

へ入学しました.入学時から学位取得までの 7 年間,細部にわたる御指導と御助言,さらに本論文

の主査として御校閲を賜りました北海道大学大学院農学研究院基盤研究部門生物機能化学分野食品

栄養学研究室の石塚敏教授に心より感謝申し上げます.また, 御多忙にも関わらず副査の御快諾と

御校閲を賜りました食品機能化学研究室の園山慶教授,食品栄養学研究室の比良徹准教授に謹んで

感謝の意を表します.さらに研究全般に関し,御助言,御指導いただいた島根大学大学院自然科学

研究科農生命科学専攻の清水英寿教授に深謝申し上げます.また,筑波大学大学院生命科学環境研

究科宮崎均教授には,血圧測定に際し,機器の提供をしていただきました.九州大学大学院農学研

究院生命機能科学部門食料化学工学講座栄養化学分野の佐藤匡央教授には,肝臓の酸化コレステロ

ール解析をしていただき,研究結果の解釈に際し,多くの御助言,御指導をいただきました.厚く

感謝申し上げます.

在学期間は,胆振東部地震および新型コロナウイルス感染症の流行によりサンプル管理などにお

いて食品栄養学研究室の皆様に筆舌に尽くしがたいほどの御支援をいただきました.また,本研究

を執行するにあたり尊い命をささげてくれたラットの冥福を祈り,全ての皆様に心より御礼申し上

げます.

2023 年 3 月

下田

智子

69

...

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