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Regulation of meiotic recombination initiation by a conserved HORMAD protein Hop1.

仮屋園, 遼 東京大学 DOI:10.15083/0002004490

2022.06.22

概要

【背景と研究概要】
 減数分裂は細胞の持つゲノムを半減させて配偶子を作る特殊な細胞分裂で、有性生殖を行う真核生物において必須である。減数分裂期前期には、減数分裂期組換えと呼ばれる相同染色体間でのDNA鎖の交換反応が行われる。これによって次世代のゲノムの多様性を生み出すとともに、減数分裂期の正確な染色体分配を保障している。
 減数分裂期組換えはトポイソメラーゼ様タンパク質Spo11によるDNA二重鎖の切断(Double Strand Breaks以下DSB)によって開始され、切断されたDNA鎖が相同鎖を用いて修復される事で完了する。Spo11は複数の補助因子と共に複合体として働く。近年の研究でSpo11を含めた多くの因子について種間を超えた保存性を有することが分かってきたが、各因子の種間で共通した機能については分かっていない事が多い。
 Spo11複合体によるDSB形成は、染色体上の位置、時間、量に関して厳密に制御されている。特にDSBが導入される場所については、特定の領域に非常に高頻度で起きる、“DSBホットスポット(以下ホットスポット)”の存在が知られている。このホットスポットはプロモータ領域など、開いたクロマチン構造の領域に多く存在する。DSB導入の制御には局所的なクロマチン構造だけではなく、より高次のクロマチン構造も関与しており、減数分裂期の染色体が凝集して形成される軸構造は、DSBの促進、抑制両方の制御に必要である。軸構造は減数分裂期特異的コヒーシンRec8複合体を中心に形成され、Spo11複合体を含む多くの減数分裂期タンパク質局在の足場となる。ゲノムワイドの局在解析により、Rec8はセントロメア周辺に加えて染色体腕部に離散して局在することが分かっており、Rec8の結合領域が凝集して軸となり、非結合領域のDNAは軸からループアウトする“ループ領域”になっていると考えられている。一方ホットスポットはRec8の非局在領域、すなわちループ領域に存在する。(図1)
 Spo11複合体は軸に局在するが、軸とホットスポットが相互作用することでホットスポットにDSB導入を行っていると考えられている。この軸—ホットスポットの連結モデルは直接観察されていないが、Spo11複合体は軸とホットスポット両方に局在することから、Spo11複合体が軸とホットスポット両方に結合することで軸とホットスポットの相互作用が生じると考えられている。しかしSpo11複合体が軸あるいはホットスポットに局在する分子メカニズムの解明は不十分である。
 本研究では分裂酵母を用いてSpo11複合体の因子Rec15と軸の因子Hop1が相互作用することを見いだした。この相互作用がRec15の軸への局在を促進して軸−ホットスポットの相互作用の基盤になっていることを明らかにした。さらに、軸構造を形成する主要な軸因子Rec10はRec15とHop1双方に結合することから、三者の相互作用によってRec10が強固にRec15を軸にリクルートしていることを、Rec15,Hop1それぞれの結合を特異的に損なうRec10の点変異アリルを用いて明らかにした。

【実験結果】
1. Hop1のゲノムワイド局在解析
 まずHop1のゲノム上の局在を調べるため、Hop1に対しChIPシーケンスアッセイを行った。比較のためRec8のChIPシーケンスアッセイも行ったところ(図2A)、Hop1の結合部位はRec8の結合部位と多くがオーバーラップするほか、一部はRec8の 結合のないDSBホットスポットともオーバーラップすることが分かった。(図2B)このHop1の局在パターンは先行研究のRec10、Rec15の局在パターンと類似していることが分かった。(図2C)さらにChIP—qPCRにより、Hop1の局在はRec15破壊株ではホットスポットから失われ、Rec10破壊株では軸、ホットスポット両方から失われることが分かった。

2. Hop1はRec10,Rec15と相互作用する
 局在解析からHop1はRec10,Rec15と相互作用する可能性が示唆されたので、共免疫沈降実験を行ったところHop1はRec10,Rec15と相互作用することが分かった。さらに酵母2ハイブリッド法でタンパク質同士の直接の相互作用を見ると、Hop1のN末端がRec10と、C末端がRec15と直接結合することが示唆された。また、種間で保存されているRec15のC末端はHop1,Rec10両方への結合に重要であることが示唆された。(図3)

3. Hop1とRec15の結合は軸とホットスポットの相互作用を促進しDSB導入を促進する
 Rec10およびRec15の局在パターンに対するHop1の寄与を調べるため、Hop1破壊株(hop1∆)においてRec15およびRec10の局在をChIP-qPCRで確認した。Hop1存在下ではRec15およびRec10の局在は軸とホットスポット両方にある。Hop1破壊株ではRec15の軸の局在が失われ、ホットスポットの局在は減少するが残る(図4A)。一方Rec10はHop1破壊株では軸の局在は残り、ホットスポットの局在が失われた(図4B)。Rec10,Rec15の局在変化は軸とホットスポットの相互作用が失われた状態を反映していると考えられる。Rec15との相互作用が失われるHop1の点変異株(hop1-8A)においても同様の結果が得られ(図4A,B)、破壊株、点変異株ともにDSBの減少による組換えの減少が見られた(図4C)。このことからHop1はRec10,Rec15との相互作用によって、軸とホットスポットの相互作用に寄与し、DSBを促進していると考えられる。

4. Rec10は直接ならびにHop1を介してRec15を軸にリクルートしてDSBを導入する
 先行研究からRec10はRec15とHop1双方と直接相互作用することが知られている。Rec10とRec15の直接相互作用は本研究で見つかったHop1とRec15との相互作用と冗長に軸−ホットスポット連結とDSB導入に働いているのではないかと考えた(図5A)。そこで、それぞれの結合を損なうRec10の点変異を作成し、DSBによる組換え率を測定した。すると、それぞれの点変異単体では組換え率は半減にとどまるが、hop1破壊変異とRec15と相互作用できないRec10点変異(E309A)を組み合わせると組換え率はrec10∆同様に検出限界以下になった(図5)。これは上記のRec10が二つの経路でRec15を軸にリクルートするというモデルに合致する結果である。

5. Rec10ホモログのRed1とSYCP2は予測される二次構造が類似している
 Rec10のホモログである出芽酵母Red1,マウスSYCP2について配列から二次構造予測を行ったところ、Rec10のHop1並びにRec15との相互作用部位を含むN末端で予測二次構造の類似が見られた。(図6)

【考察と展望】
 今回の研究で分裂酵母のHop1には軸とホットスポットの相互作用に寄与してDSBを促進する機能があることが明らかになった。Hop1は動物、高等植物、菌類で保存されており、出芽酵母やマウスでは軸形成、組換えの促進、組換え修復のチェックポイント、相同染色体の対合など多数の機能を担っている。一方分裂酵母の軸構造は出芽酵母やマウスに比べて発達しておらず、分裂酵母のHop1の機能は組換えの促進以外の機能には寄与がほとんどない事から、これはHop1の根源的な機能であると推測できる。
 また、Rec10は直接の結合とHop1を介する結合の二経路でRec15を軸にリクルートすることが今回の研究で明らかになった。Rec10は軸の主要構成因子でターンオーバーの少ないと考えられる一方、Hop1の持つHORMAドメインは細胞内の状態を感知して他のタンパク質と結合乖離をする機能を持っている。このことから二つの経路はRec10が細胞内の状況に応じて結合するHop1の量を変えることでDSBの量を調節すると同時にHop1を介さない直接の結合で最低限のDSBを担保する仕組みであると考えられる。
 出芽酵母においてRec15ホモログのMer2の軸への局在はHop1ならびにRec10ホモログのRed1に依存することが知られているが、直接の相互作用については不明である。マウスにおいてはRec15ホモログIHO1がHop1ホモログのHORMAD1と結合し、IHO1の軸局在はHORMAD1に依存するが分かっているが、Rec10ホモログと推定されるSYCP2の関与は不明である。今回分裂酵母で判明したRec10のHop1,Rec15との相互作用領域は二次構造上Red1、SYCP2と類似性が高く(図6A)、Rec10、Hop1との結合に必要なRec15C末端の配列も種間で保存性があることから、三者の結合による軸とホットスポットの相互作用も種を超えて保存されている機構である可能性が示唆される(図7)。

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