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ゲノム網羅的 DNAメチル化解析に基づく尿路上皮における発がんリスク診断基準の確立

津村, 功志 東京大学 DOI:10.15083/0002004524

2022.06.22

概要

尿路上皮がんは、時間的・空間的多発性を示すという臨床病理学的特徴を有する。腎盂・尿管・膀胱に同時性・異時性に、複数個所にあるいは広範囲に、腫瘍が認められることがある。この多発性の機序の一つとして、全尿路の尿路上皮が尿中の発がん物質等に一様に継続して曝露されることによるフィールド効果が想定されている。DNAメチル化異常は発がんの主要なエピジェネティック機構で、プロモーター領域のCpGアイランドのDNAメチル化亢進によるがん抑制遺伝子のサイレンシングや、DNAメチル化減弱によるゲノム不安定性が、ヒトの発がんに寄与すると考えられている。従来の報告で、DNAメチル異常が、諸臓器がんの発生に前がん段階から寄与することが示されている。尿路に関して、尿路上皮がん症例の非がん尿路上皮は、未だ組織学的に特記すべき所見を示さないのにもかかわらず、非尿路上皮がん症例の正常尿路上皮と比べて、DNA複製の際に娘鎖にDNAメチル化を複製する維持メチル化機構を担うDNAメチル化酵素DNMT1を既に高発現している。異形成から尿路上皮がんに進展するにつれて、さらにDNMT1の発現が亢進することが報告されている。他方で、尿路上皮がんの発生リスク診断が可能となれば、禁煙指導や頻回の尿細胞診検査等、予防ならびに早期診断の戦略を立て得る。DNAメチル化異常はフィールド効果に曝露された非がん尿路上皮に蓄積され、DNMT1を含む維持メチル化機構によりゲノム上に安定に保存されるため、尿路上皮における発がんリスクを推定するためのよい指標となると期待される。そこで本研究は、尿路上皮がん発生早期におけるDNAメチル化異常の意義の理解を進め、発がんリスク診断基準を確立することを目的とした。

　解析対象とした学習コホートは、尿路上皮がん47症例の切除検体より得られた、非がん尿路上皮(N)47検体と、同一症例の尿路上皮がん組織(T)46検体である。検証コホートとして、尿路上皮がん64症例の切除検体より得られた、N64検体を解析に供した。対照として、非尿路上皮がん26症例（腎細胞がん・後腹膜脂肪肉腫・後腹膜神経鞘腫）の切除検体より得られた正常尿路上皮(C)26検体を解析に供した。本研究は、全ての対象患者から、書面によるインフォームドコンセントを受け、国立がん研究センター研究倫理委員会ならびに慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認と研究許可を受け、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。

　ゲノムDNAはEZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research)を用いてバイサルファイト変換に供し、Infinium HumanMethylation450K Bead Chip (Illumina)を用いて485, 764 CpG部位のDNAメチル化状態を1塩基解像度で解析した。Infinium解析によって得られたDNAメチル化率は、PyroMark Q24(QIAGEN)を用いたパイロシークエンスならびにMassARRAY Analyzer 4(Sequenom)を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化法・飛行時間型質量分析法で検証した。パイロシークエンスならびにMassARRAY解析にあたっては、定量性の良好な至適PCR条件を決定しPCRバイアスを排除した。なお、製造者プロトコールの記載に従ってMassARRAYシステムによって1つの測定値を与えられる連続したCpG配列を、「CpGユニット」と定義している。さらに、GeneReadDNAseqTargetedPanelsV2(QIAGEN)を使用し、MiSeq(Illumina)で配列決定して、160がん関連遺伝子の変異を検索した。fastqファイルはGenomeJack bioinformatics pipeline (Mitsubishi Space Software)を用いて解析した。

　Infinium解析の結果に基づき、学習コホートにおいて26C検体と47N検体の間で有意にDNAメチル化率の異なる5,428プローブ(Welch-t検定、P<0.05、DNAメチル化率の平均値の差0.1以上)を同定した。26C検体から47N検体、さらには46T検体へと段階的にDNAメチル化率の変化する327,371プローブを同定した(Jonckheere-Terpstra傾向性検定、P<0.05)。両検定で有意なプローブは2,750個存在した。これら2,750プローブにおけるDNAメチル化異常は、病理組織学的に未だ特記すべき所見を示さないN検体において既に起こり、その異常がT検体に継承されると考えられた。この2,750プローブにおけるDNAメチル化率を用いた主成分分析では、N検体は明らかにC検体と異なる分布を示し、またC検体とT検体の中間に位置しており、前がん段階Nにおいて既に異常なDNAメチル化プロファイルが確立し、フィールド効果に寄与すると考えられた。

　他方で、アンプリコンシーケンスの結果、N検体における非同義置換（一塩基多型[single nucleotide variants]ならびに挿入/欠失[insertion/deletion]）、コピー数異常（増多・欠失）の検出数とC検体における検出数との間に、有意な差異を認めなかった（Welch-t検定）。またN検体における検出数は、対応するT検体と比較して、有意に少なかった（pairedt検定）。すなわち、N検体において未だ遺伝子変異は稀で、ゲノム異常の観点からN検体はT検体と明らかに異なっていた。この知見は、エピゲノム異常がゲノム異常に先行してフィールド効果に寄与することを示唆している。

　次に、2,750プローブのDNAメチル化率を用いてC検体からN検体を区別するための受信者動作特性(receiver operating characteristic［ROC］）解析を行ったところ、N検体におけるDNAメチル化異常を指標として発がんリスク診断を行える可能性が示唆された。そこで、ROC解析で曲線下面積（area under the curve）が0.95を超えるTENM3・TLR1・HOXC4・PRDM16・HOXC4;HOXC5;HOXC6・CPVLに設計された6プローブCpG部位のDNAメチル化率について、パイロシークエンス・MassARRAYで技術的検証を行った。全6CpG部位において、Infinium解析で得られたDNAメチル化率とパイロシークエンス・MassARRAYで得られたDNAメチル化率はよく一致した。パイロシークエンス・MassARRAYによる精密定量値を用いて再度ROC解析を行い、診断閾値を設定した。パイロシークエンス・MassARRAYではInfiniumプローブ部位に隣接するCpG部位/ユニットのメチル化率も測定可能であるが、これらを合わせた10マーカー候補CpG部位/ユニットの診断閾値を用い、高い感度・特異度でN検体をC検体から区別し、発がんリスク段階にあると診断できることが分かった。

　同定したマーカーCpG部位の多くは遺伝子体部に位置しているか、もしくはCpGアイランド・アイランドショア・アイランドシェルフには位置していなかった。さらに、The Cancer Genome Atlas（TCGA）データベースで検討したところ、そのDNAメチル化率とmRNA発現との逆相関は明確でなかった。マーカー遺伝子のDNA化異常は、発現異常に帰結して尿路上皮がんの発生と進展に機能的に寄与するとは言えず、むしろ発がんリスクのサロゲートマーカーである。確立したがんではない、発がんリスクの段階では、DNAメチル化異常は重要ながん関連遺伝子の発現制御領域に未だ波及していないと考えられた。

　10マーカー候補CpG部位/ユニットの中から、複数を組み合わせればさらに高い感度・特異度が得られ再現性も高まると期待されるが、臨床の現場においては短時間・低コストでの施行が重要である。そこで、2CpG部位のみを組み合わせて感度・特異度とも96%以上である診断基準を18通り策定した。検証コホートの64N検体において10CpG部位/ユニットのDNAメチル化率をパイロシークエンス・MassARRAYを用いて定量し、発がんリスク診断基準の信頼度の検証を行ったところ、9CpG部位/ユニットを用いた12通りの発がんリスク診断基準の有効性が検証された(感度92-98%)。生じるがんの悪性度等臨床病理学的な特性に関わらず、また上部尿路がんあるいは膀胱がんの別に関わらず、12通りの診断基準を用いることができることを確認した。

　尿検体は容易に、かつ非侵襲的に得ることができるため、尿検体を用いた発がんリスク診断が望ましい。尿検体には尿路上皮細胞に血液細胞等種々の細胞が混入しているが、高速液体クロマトグラフィーなどのDNAメチル化診断系を用いれば、混入した細胞からDNAメチル化異常をきたしている異常細胞を識別した上でDNAメチル化率の精密定量ができるので、前がん段階にある尿路上皮細胞の割合が低い場合でも、本研究で開発した基準は発がんリスク診断に有用と考えられる。膀胱がんの既往がある経尿道的腫瘍切除術後の患者で、明らかな再発がないことが臨床的に確認されている時点の尿検体を用いて予備的に解析したところ、そのDNAメチル化率は本研究におけるN検体のDNAメチル化率と同等程度であった。今後多数の尿検体を用いた検証を加えることで、尿路上皮における発がんリスク診断の実用化が期待できる。

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