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Zonisamide upregulates neuregulin-1 expression and enhances acetylcholine receptor clustering at the in vitro neuromuscular junction

井上, 太郎 名古屋大学

2022.01.27

概要

【緒言】
　重症筋無力症、先天性筋無力症候群、またいくつかの神経疾患においてアセチルコリンレセプター(AChR)のクラスタリングの低下による神経筋接合部(NMJ)における障害が認められる。しかし、現在AChRクラスタリングを促進させる治療法はない。
　抗てんかん薬であるゾニサミド(Zonisamide, ZNS)はパーキンソン病(PD)の治療薬としても用いられている。以前我々は坐骨神経切断モデルマウスの切断側の支配筋においてChrne、ColqなどのAChR関連遺伝子の発現量を増加させたと報告した。これよりZNSがAChRクラスターに何らかの影響を与える可能性が考えられた。我々はZNSのAChRクラスターに対する作用を確認するために、骨格筋、運動神経細胞としてマウスの細胞株を用いた共培養システムのプロトコールを作成、この共培養(in vitro)にてNMJを再現しZNSのAChRクラスタリングに対する作用とその機序について評価、検討した。

【対象および方法】
　共培養には骨格筋細胞としてC2C12(mouse myoblast cell line)、運動神経細胞としてNSC34(mouse neuroblastoma-spinal motor neuron hybrid cell line)を選択した。これらを図1Aに示すようなプロトコールを作成し共培養を行い、神経筋接合部を再現した。C2C12を100cells/mm2の濃度にて増殖培地(DMEM、10% fetal bovine serum、1% Pen-Strep)に播種、翌日分化培地(DMEM、2% horse serum、1% Pen-Strep)に変更、播種後3日にNSC34を50cells/mm2の濃度にて播種した。共培養後の培地はDMED/F12に0.5% horse serum、1% non-essential amino acid、1% Pen-Strepを添加し作成した。ZNSは0、1、10、20μMの濃度にて共培養時よりに投与された。共培養後6日にα-bungarotoxin(α-BTX)にてAChRクラスターを染色し、そのArea、Intensity、LengthについてMetaMorphを用いて計測した。また、qRT-PCRを用いてAChR関連遺伝子の発現量を調査した。

【結果】
C2C12とNSC34の共培養によるin vitro NMJの再現
　Drug screeningを簡便かつ再現性のあるin vitro NMJにて行うため、骨格筋細胞C2C12と運動神経細胞NSC34を用いて図1Aに示すような共培養プロトコールを作成した。C2C12播種後9日、共培養後6日において共に十分に分化していることを確認した(図1B)。またNSC34をPeripherinにて緑色に染色、AChRをα-BTXにて赤色に染色し、NSC34のneuritesの先にC2C12のmyotubeにおけるAChRクラスターがあることを確認した。

ZNSはAChRクラスター、収縮するmyotube数、そしてAChR関連遺伝子の発現を濃度依存的に増加させるが、C212単培養下にはこれらの変化は認めない
　共培養と同時にZNSを添加し共培養後6日にAChRクラスターを評価した(図2A)。結果、AChRクラスターはZNS濃度依存性に増加していることが示された(図2B、C)。また共培養下において骨格筋細胞の一部は自発的に収縮が見られる。この収縮する骨格筋細胞も濃度依存的に増加していることが分かった(図2F)。続いて、AChR関連遺伝子の発現について調査した。すると、Chrne、Colqが以前の報告と同様に濃度依存的に増加していることが分かった。またMyod1、Nrg1も同様に増加していた(図2D、E)。しかし、これらのいずれの変化もC2C12単独培養下では認められず(図S1C、D、E)、NSC34単独培養下でもNrg1の増加は認められなかった(図S1F)。この結果より、ZNSが作用するにはin vitro NMJが必要であること、その作用にはニューレグリン-1(Nrg1)が関与している可能性が考えられた。続いて、共培養した培地に含まれる分泌因子がZNSによるAChRクラスターに関与しているか検討するために、共培養された培地を分化したC2C12に2日間、1日間、6時間投与した。しかし、いずれにおいても共培養された培地はC2C12におけるAChRクラスタリングに影響を与えなかった(図3)。この結果からAChRクラスタリングに対するZNSの効果は核細胞より培地に分泌された物質を介したものではないことが示唆された。

アグリンはinvitroNMJにおいてAChRクラスタリングに必要であるが、ZNSの効果を媒介しない
　ZNSのAChRクラスタリングに対する効果にアグリンが関与しているかを確認するために、抗アグリン抗体を共培養下に48時間投与した。結果、抗アグリン抗体がAChRクラスタリングをZNS存在下、非存在下いずれにおいても抑制することが示された(図4E)。一方Chrneの発現量には影響を与えなかった(図4F)。よって、ZNSはAgrin依存的にAChRクラスタリングを増強させているが、Agrin非依存的にChrneの発現量ぞ増加させていることが示唆された。

ZNSはin vitro NMJにおいてニューレグリン-1(Nrg1)の発現を誘導し、AChRクラスタリングを誘導するためにNrg1/ErbB signalingを必要とする
　ZNSのAChRクラスタリングに対する作用におけるNrg1の関与を検討した。まず共培養下にZNSを6日間投与と、Nrg1を2日間投与したところAChRクラスタリング、Chrne発現量が共に増加した。またZNS投与とNrg1投与間に差を認めなかった(図5A、B、C)。このことからZNSがNrg1と同様の効果を示すことが示唆される。次に、ZNSの効果にNrg1とその受容体であるErbBが必要であるかを、ErbBのinhibitorを使用して検討した。結果、ZNSによるAChRクラスタリング、Chrne遺伝子発現量の増強はErbB inhibitorを投与することにより共に抑制された(図5D、E、F)。図2Eと図S1Fの結果よりZNSがin vitro NMJにおいてNrg1の発現を誘導することがわかっているため、図5よりZNSのAChRクラスタリングの誘導はNrg1/ErbB signalingを介していることが示唆された(図5G)。

【考察】
　共培養下に、ZNSはAChRクラスタリング、筋収縮、そしてNrg1、Chrneを含むNMJ関連遺伝子の発現を促進させた(図2C、D、E、F)。加えて、C2C12、NSC34単培養下にはこれらの変化は認められなかった(図S1C、D、E、F)。つまりZNSは運動神経細胞と骨格筋細胞がNMJを形成している状態においてのみ作用していることが分かった。さらにAChRクラスタリングとChrneの発現に対するZNSの効果はNrg1/ErbB signalingに依存していた(図5D、E、F)。
　ZNSは抗てんかん薬であり、PDに対する治療薬としても使用されている。PDモデルマウスにおいてチロシン水酸化酵素を増加させることによりドパミン作動性神経細胞におけるドパミンの産生を増加させることが報告されている。一方Nrg1とErbB4はPDモデルマウスにおいてドパミン作動性神経細胞の保護作用や中脳におけるドパミン濃度の上昇、チロシン水酸化酵素の発現および活性の増加が報告されている。これらから、PDモデルマウスにおいてZNSとNrg1がドパミン作動性神経細胞に同様の作用を及ぼすことが示唆される。また、筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウス、Charcot-Marie-Tooth病モデルラットにおいてもNrg1の関与が指摘されている。つまり、ZNSはこれらの疾患に対しても有効である可能性がある。今後、さらなる研究、試験によりNMJに対するZNSの効果が明らかになるかもしれない。

【結語】
　我々は、C2C12、NSC34を使用し簡便な共培養システムを作成した。これを用いてZNSがAChRクラスタリングを増強させ、関連遺伝子の発現を増加させることを示した。そしてZNSのNMJに対する作用はNrg1/ErbB signalingを介していることが示唆された。

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