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Integrated diagnosis based on transcriptome analysis in suspected pediatric sarcomas

市川, 大輔 名古屋大学

2022.04.22

概要

【緒言】
小児固形腫瘍は多様な新生物群であり、適切な治療法の選択にはサブタイプを含めた正確な診断が必要である。一部の疾患では、特異的な腫瘍マーカーが診断に有用であるが、ほとんどの腫瘍は特異的な腫瘍マーカーを持たず、診断は病理組織学的評価に強く依存している。しかしながら、多くの小児固形腫瘍では未分化小型円形細胞の形態を示し、疾患特異的な病理組織所見に乏しいため、その診断は非常に困難である。このような状況において、近年、疾患特異的な遺伝子変異が多数報告されている。 特に、ユーイング肉腫における EWSR1-FLI1 や胞巣型横紋筋肉腫における PAX3/7- FOXO1 をはじめとする疾患特異的な融合遺伝子を検出することで、小児固形腫瘍の診断精度を改善することができる。さらに、未分化小円形細胞肉腫における BCOR- CCNB3 および CIC-DUX4、NUT carcinoma における ZNF532-NUTM1、腎明細胞肉腫における BCOR-internal tandem duplication、紡錘細胞型／硬化型横紋筋肉腫における MYOD1 p.Leu122Arg など、いくつかのサブタイプを定義する体細胞遺伝子変異も同定されている。これらの遺伝子変異の検出は、小児固形腫瘍の診断において、非常に有力な方法であるが、従来の手法を用いてこれらの遺伝子変異を検出するには限度がある。
本研究では、小児肉腫が疑われた症例において RNA シーケンスを用いた遺伝子変の検出と解析を行い、鑑別診断における臨床的有用性の評価を行った。

【対象及び方法】
1990 年から 2018 年に名古屋大学医学部附属病院小児科で診療を受け、骨軟部肉腫が疑われた 47 例を対象とした。全例で凍結組織検体より抽出した RNA を用いた RNAシーケンスにより、遺伝子変異解析を行った。さらに、小児悪性腫瘍に精通した複数の病理医による病理組織診断の再検討を行い、RNA シーケンス結果と比較することにより、診断プロセスにおける RNA シーケンスの有用性について評価した。

【結果】
骨軟部肉腫が疑われた 47 例において、RNA シーケンスを行い 23 例(49%)で診断的意義のある遺伝子変異を検出した。このうち、22 例は既知の遺伝子変異であった。残りの 1 例は、病理組織学的特徴が既に知られている腫瘍と一致しない未分化肉腫と診断された症例であり、新規となる SMARCA4-THOP1 融合遺伝子を同定した。
小児悪性腫瘍に精通した複数の病理医による組織学的再評価では 47 例中 5 例が未分化肉腫と診断された。RNA シーケンスでは、この 5 例中 4 例で疾患特異的と思われる遺伝子変異を検出し、新規の診断がえられた。一方、47 例中他の 5 例では、得られた遺伝子変異情報により、疾患カテゴリーが変更されるなどの診断精度の向上がえられた。全体として、RNA シーケンスの結果により 9 例において病理組織診断の変更がなされた(図 1)。
新規の融合遺伝子として、SMARCA4-THOP1 融合遺伝子を同定した。この症例では融合遺伝子に加え、対立アリルに SMARCA4 遺伝子のスプライスサイト変異が検出さ れ、SMARCA4 遺伝子の両アリルの不活化が示された。SMARCA4 遺伝子の不活化は胸部肉腫において報告されており、本症例においても発がんへの関与が示唆された(図 2)。未分化肉腫と診断された、他の 1 例では PTCH1-GLI1 融合遺伝子を検出した。これを HEC293T 細胞株に強制発現すると、ヘッジホッグシグナルが活性化することが明らかになった。ヘッジホッグシグナルの活性化は基底細胞癌や髄芽腫で報告されており、本症例でも発がんに関与していることが示唆された。
さらに、一部の症例においてクラスタリング解析をおこなったところ、横紋筋肉腫の症例が特定のクラスターを形成した(図 3a)。遺伝子発現解析においては、横紋筋肉腫症例において、MYOG 遺伝子と CHRNG 遺伝子が高発現していることが示された(図 3b)。これらの遺伝子は横紋筋肉腫に特異的な遺伝子であると報告されており、発現解析が診断に有用である可能性が示唆された。

【考察】
本研究では、47 例中 5 例において、FISH 解析などを含む病理組織学的レビューによって未分化肉腫と診断され、この 5 例のうち 4 例(80%)は RNA シーケンスによって検出された遺伝子変異に基づいて、新規の診断がえられた。さらに、他の 5 人の患者は、検出された遺伝子変異に基づいて、予後に関連する追加情報を得た。したがって、 RNA シーケンスは、未分化肉腫の診断およびサブカテゴリーの決定に特に有用であると考えられる。これらの知見は、骨軟部肉腫が疑われる小児症例において診断プロセスにおける RNA シーケンス解析の臨床的価値を支持するものである。
特に本研究では、RNA シーケンスを用いた統合診断を行うことで、SMARCA4 欠損未分化肉腫、NUT-carcinoma、胞巣型横紋筋肉腫、滑膜肉腫と診断された症例において確定診断をえることができ、化学療法レジメンの決定などの患者管理に有用であった。
遺伝子発現プロファイルに基づくクラスタリング解析では、横紋筋肉腫症例を主な構成要素とするクラスターが同定された。このクラスターでは、MYOG と CHRNG 遺伝子が過剰に発現しており、遺伝子発現プロファイルを参照することで、小児の肉腫における診断や分類に役立つ可能性が示された。遺伝子発現解析を行うことは、疾患特異的な遺伝子変異を持たない症例の診断において有用であると考えられる。本研究では症例数が少数であり、他の腫瘍について十分な解析を行うことができなかった。他の診断的価値のあるクラスターを同定するには、今後、さらに多くの症例について解析を行う必要がある。

【結論】
RNA シーケンスを用いた遺伝子解析は、骨軟部肉腫が疑われる小児症例の病理組織学的診断や層別化された治療戦略の決定に有用であると考えられる。

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