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Synechocystis sp. PCC6803の酸性ストレス応答機構の解析

甲賀 栄貴 Hidetaka Kohga 東京理科大学 DOI:info:doi/10.20604/00003575

2021.06.09

概要

植物は、環境変化に対して鋭敏に応答・順応することによって生存し続けてきた。環境変化とは温度・光などの物理的要因、二酸化炭素濃度・土壌中の塩濃度・水分量・重金属濃度・各種栄養素の濃度とい った化学的要因の変動を指し、植物の成長に好ましくない環境変化が「環境ストレス」となる(Hur et al., 2004; Liu et al., 2011; Wen et al., 2011)。例えば、pH 5.0~5.5 以下の酸性度の土壌として定義される酸性土 壌は、植物に酸性ストレスを与え、植物の成長を阻害することが知られている(Edmeades et al., 1995)。植 物と同様の酸素発生型の光合成を行うシアノバクテリア Synechocystis sp. PCC6803(以下 Synechocystis)は、ゲノム解読が完了しており、遺伝子工学的な操作が容易で、植物を扱う時間と比べ、世代時間が短い。こういった扱いやすい特徴を持つため、本研究では、Synechocystis が酸性ストレスに応答するメカニズ ムを解明することを目的とした。そして、その応答機構を高等植物に応用することで、酸性土壌でも生 育できる作物の作出を目標とした。

ABC(ATP-Binding Cassette)トランスポーターが環境ストレス耐性に関与することが知られている。本研究では、大腸菌における ABC トランスポーターを構成するタンパク質 Hly ファミリーと相同性を示す Synechocystis の Hly トランスポーターSll1180、Sll1181、Slr1270 の酸性ストレス下での役割に着目した。Sll1180 について発現解析と局在解析を行ったところ、Sll1180 は酸性ストレスに応答し、細胞膜上に局在することが確認された。これらのことから Sll1180 は、酸性ストレスに応答し、何らかの物質を輸送する可能性が示唆された。

大腸菌において Hly トランスポーターは、HlyA の輸送を行うことが報告されている(Wandersman and Delepelaire., 1990; Lee and Schneewind, 2001; Costa et al., 2015; Holland et al., 2016)。Sll1180 は、HlyA と相同性のある Sll1951 と相互作用することが報告されている(板垣修士論文, 2017)。Slr1270 タンパク質は Sll1951 の輸送に関与する(Oliveira et al, 2016)。Synechocystis の細胞において Sll1180、Sll1181 の有無によって、Sll1951 の輸送活性がどのように変化するかを調べた。Sll1180、Sll1181 を持つ野生株は、Sll1951の輸送していることが確認できた。しかし、Sll1180、Sll1181 を持たない変異株は、Sll1951 を細胞外に輸送できなかったことから、Sll1180、Sll1181 は Sll1951 の排出に関わることが明らかになった。

Sll1951 は、細胞表層にある S-layer を形成するタンパク質である(Sakiyama et al., 2006; Trautner and Vermaas, 2013)。また Sll1951 はバイオフィルムの形成にも関与し、Sll1951 過剰発現株のバイオフィルム 部分は高い酸耐性能を持つことが明らかになっている(石川修士論文, 2017; 高橋修士論文, 2019)。Sll1180、 Sll1181、Slr1270 の変異株は、酸性ストレス条件下において増殖の抑制が確認されている(板垣修士論文, 2017)。これらの変異株は、Sll1951 を輸送することができないため、酸性ストレスに強い感受性を示し ている可能性が示唆された。また Sll1951 は負電荷を帯びたアミノ酸を多く持つため、プロトンへの流 入を抑える可能性が考えられた。酸性ストレス下で応答する Sll1180、Sll1181 は、Sll1951 を輸送し、S- layer を形成することで外的ストレスから細胞を守る重要な役割を持つことが明らかになった。

酸性ストレス条件下で培養した Synechocystis の野生株、sll1180、sll1181 変異株において細胞が肥大している傾向が見られたが、slr1270 変異株においては、細胞体積の増加が見られなかった。また酸性ストレスに感受性を示す slr2019 株においても、細胞体積の増加が見られず、細胞体積を増加できないことが酸性ストレス下での生育抑制に繋がることが示唆された(Matsuhashi et al., 2015)。Synechocystis は、酸性ストレス下では細胞体積を増加させるシステムを持つ。それにより細胞内の恒常性を維持している可能性が考えられたため、酸性ストレス下での細胞の肥大化に着目した。

暗所処理により、同調培養することで、分裂のタイミングを合わせた野生株において酸性ストレスでどのタイミングで大きくなり、またどの程度肥大するかを評価した。すると明所移動後 16 時間後から、細胞長は有意に増加し、24 時間後の時点で pH 6.0 の細胞は、pH8.0 と比較すると約 3 倍の体積となった。また、酸性ストレス条件では、至適条件と比べて倍加時間が長く、明らかに細胞数の増加が抑制されていた。増殖が抑制されているにもかかわらず、細胞の成長のみが行われるため、細胞が肥大している可能性が示唆された。これらのことから酸性ストレス下では細胞分裂が阻害されていることが予測された。

次に細胞分裂において最も重要なタンパク質 FtsZ について解析を行った。発現解析の結果より、FtsZのタンパク質量は至適条件では 16 時間付近で 0 時間の時点と比較して 3 倍に増加した。大腸菌において細胞内の FtsZ のタンパク質は、細胞分裂周期に応じて変化し、FtsZ 量の増加と細胞分裂のタイミングには相関がある(Männik et al., 2018)。大腸菌 と同様に Synechocystis においても FtsZ 量の増加と細胞分裂のタイミングに相関が見られた。酸性ストレス条件下においては、FtsZ のタンパク質量は大きな量の変動は見られなかった。至適条件では、FtsZ が増加した 16 時間後から 24 時間の時点で 1 回目の細胞分裂が行われることが予測されたが、酸性ストレス条件下では FtsZ 量は少なく、細胞分裂を行うには充分量でなかった可能性が考えられた。細菌における細胞サイズは、一定量の細胞長の増加と適切なタイミングでの分裂を数世代繰り返すことによって、一定に保たれていることが報告されている(Taheri-Araghi et al., 2015 and 2017)。本研究での酸性ストレス条件下では、FtsZ 量が十分量でないため適切なタイミングでの細胞分裂は行われず、細胞分裂頻度が低下し、細胞の肥大化を促した可能性が予測された。

酸性ストレス下での FtsZ の減少の原因として、FtsZ の分解の促進に着目した。至適条件、酸性ストレス条件で培養した細胞における FtsZ の分解速度の比較を行ったところ、酸性ストレス条件下では、FtsZの分解が促進されていることが示された。FtsZ の分解や、Z リング形成の阻害に関与する因子については、大腸菌において ClpXP というプロテアーゼが同定されている(Camberg et al., 2009; Sugimoto et al., 2010)。このことから、Synechocystis においても ClpXP のような FtsZ を分解する機構が存在する可能性が示唆された。

Synechocystis においては、Sll0535(ClpX)と、3 つの ClpP ホモログ(Slr0542(ClpP1, Sll0534(ClpP2), Slr0165(ClpP3))が存在する(Sokolenko et al., 2002)。大腸菌、Caulobacter など様々な細菌類において、ClpXPはストレスによって誘導されることが報告されている(Michel et al., 2006; Joshi and Chien, 2016; Gottesman, 2019)。Synechocystis の RNA-seq 解析においても、clpX 及び 3 つの clpP 遺伝子は、様々なストレスに応答することが明らかになっている(Kopf et al., 2014)。このようにシアノバクテリアの ClpXP においても、ストレス環境への応答や順化に関与することが予想された。そこで酸性ストレス条件での Synechocystisの ClpXP の働きに着目した。

clpX 及び 3 つの clpP 遺伝子について転写解析を行ったところ、酸性ストレス条件下において 4 つの clpXP 遺伝子の転写量は、至適条件と比べて有意に増加していた。このことから、酸性ストレス条件下では ClpX による Z リング形成の阻害や、3 つの ClpP によって FtsZ の分解が促進されている可能性があることが示唆された。Synechocystis は、3 つのClpP ホモログを持つが、どの ClpP が FtsZ に対して分解能を持つか調べるため、大腸菌の細胞内で ClpX と 3 つの ClpP を発現させ、大腸菌の FtsZ に対しての分解能の比較を行った。すると、ClpP3 を除きClpP1、ClpP2 は FtsZ の分解活性を示した。ClpP3 が大腸菌の FtsZ に対して分解活性を示さなかったため、Synechocystis においても ClpP1、ClpP2 は ClpX と複合体を形成し、FtsZ の分解を行う可能性が示唆された。

さらに ClpP1、ClpP2、ClpX、ClpP2X について変異株を構築し、酸性ストレス下における変異株を観察した。clpP1、clpP2、clpP2X 変異株では、酸性ストレス条件下で肥大しない細胞が観察されたが、clpX変異株では小さな細胞は観察されず、野生株よりもはるかに肥大した細胞が観察された。各変異株では、酸性ストレス下において野生株と異なる表現型が観察された。ClpXP は酸性ストレス下での細胞分裂の制御に関わる可能性が示唆された。

本研究により、Synechocystis において酸性ストレス下で応答する Sll1180、Sll1181 は、Sll1951 を輸送し、S-layer を形成することで外的ストレスから細胞を守る重要な役割を持つことが明らかになった。また本研究は、シアノバクテリアの酸性ストレス下における細胞分裂の抑制機構を明らかにした初めての研究である。本研究により、Synechocystis が酸性ストレス下で細胞分裂タンパク質 FtsZ の分解、FtsZ を欠乏させることによって一時的に細胞分裂頻度を減らし、細胞体積を増加させるシステムを持つことを明らかにした。また Synechocystis の ClpXP は、FtsZ を分解することによって FtsZ を介して酸性ストレス下での細胞分裂の抑制に関与している可能性が示唆された。ストレスがあるときは細胞分裂を積極的に行わないことで酸性ストレス環境に耐えていることが予測され、細胞形態を変化させることによって生存を有利にする機能を持つ可能性を見出した。

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