シロイヌナズナの長期高温耐性メカニズムの解明

概要

背景・目的
高温は作物の生長や収量に大きな影響を及ぼす重大な環境因子である。地球規模ではここ 30 年の温度上昇により，主要穀物である小麦やトウモロコシの収量が 3-5%も減少したと報告されており，将来的に安定した食糧供給を望む上でも，高温耐性作物の作出および耐性メカニズムの理解が植物科学の重要な課題とされている。

植物の高温ストレス応答に関しては，これまでにシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を含むモデル植物を中心に研究が進められ，高温耐性に必須の遺伝子群の他，高温耐性を付与することの出来る遺伝子が見出されているものの，応用面で十分な成果を得るまで至っていない。興味深いことに，自然界には高いストレス耐性を示す植物が存在する一方で，同じ種であってもそのような耐性が失われている例がある。しかしながらその背景でどのような遺伝子が働いているのかに関しては多くが不明である。

シロイヌナズナには世界中に 1000 種類を超えるaccession（異なった産地由来の近交系統;エコタイプ）が存在し，accession 間にはストレス耐性を含む様々な表現型にバリエーションが確認されている。長期的な高温ストレス（37℃_7 日間）に対する耐性を評価したところ，高温耐性に大きな多様性を見出した。この高温耐性評価結果を用いて Genome wide association study (GWAS)を行ったところ，耐性と相関を示す有意な SNP は検出されず，この高温耐性については，accession により寄与する遺伝子座が異なる，あるいは複数の遺伝子座が耐性に関与することが示唆された。そこで本研究では，シロイヌナズナにおける長期高温耐性メカニズムの解明を目的に，1) Col-0 とMs-0 を用いた高温耐性遺伝子の単離・解析，2) Da(1)-12 と Ei-2 を用いた高温耐性遺伝子の単離・解析，3) 長期高温ストレス応答に関与する遺伝子の同定を行った。

第一章 Col-0 と Ms-0 を用いた高温耐性遺伝子の単離・解析
1-1. LHT1 遺伝子座の同定
シロイヌナズナ accession の長期高温耐性評価試験の結果から，長期高温耐性 accession Col-0・長期高温感受性 accession Ms-0 がそれぞれ見出された。これらの原因遺伝子座を同定するために Col-0 と Ms-0 を交配した F1 種子を作出し，次世代の F2 種子を用いて遺伝子マッピングを行った。その結果，原因遺伝子座が第 2 染色体に座上することが明らかとなり，その領域を Long-term Heat Tolerance 1(LHT1)遺伝子座と命名した。LHT1 遺伝子を同定するために，長期高温耐性を示さない Ms-0 に，長期高温耐性を示す Col-0 を 5 回戻し交配することで，LHT1 遺伝子座近傍のみを Ms-0 由来のゲノムに置換した準同質遺伝子系統(Near Isogenic Line; NIL)を作出した。遺伝子型を元に LHT1 遺伝子座近傍で組換えの生じた系統を探索し，長期高温耐性を示す NIL_Col-0，長期高温耐性を示さない NIL _Ms-0 をそれぞれ獲得することに成功した。これらの遺伝子型解析の結果，LHT1 遺伝子座を 33 kbp に絞り込むことに成功した。次に，Col-0 と Ms-0 の間に存在する LHT1 遺伝子座の全多型を検出するため，Ms-0 のゲノムシークエンスを行った。ゲノム配列を比較した結果，絞り込まれた LHT1遺伝子座内に存在する 11 遺伝子のうち，アミノ酸の非同義置換を伴う多型が 3 遺伝子に，3 bp(1 アミノ酸)の欠損が 1 遺伝子に生じていることが明らかとなった。Col-0 と Ms-0 を交雑した F1 が長期高温耐性を示すことから，Ms-0 側に劣勢突然変異が生じていると考えられたため，Col-0 から候補として考えられた上記 4 遺伝子をそれぞれクローニングし，長期高温感受性を示す NIL_Ms-0 に遺伝子導入する相補試験を行った。これら 4 遺伝子のうち，Ms-0で 3 bp の欠損が見られた遺伝子のCol-0 型を導入したNIL_Ms-0 の高温耐性が向上したことから，この遺伝子が長期高温耐性の原因遺伝子 LHT1 であることが強く示唆された。

1-2. LHT1 の機能解析
LTH1 は RNA 結合タンパク質をコードする遺伝子であった。これまでの報告において， LHT1 は植物の病害応答や miRNA 生合成に関与する遺伝子である一方，高温ストレスをはじめとする非生物ストレス耐性への関与については報告のない遺伝子であった。そこで LHT1 遺伝子の高温ストレス応答への関与を調べるために遺伝子発現解析を行ったところ，長期高温ストレスにより発現誘導されることが明らかとなった。次に，Ms-0 型 LHT1 が短期的な高温ストレス，あるいは高温馴化能へも影響を及ぼすのか調べたところ，いずれのストレスにも NIL_Ms-0 がCol-0 と同等の耐性を示したことから，Ms-0 型 LHT1 が長期的な高温ストレス応答特異的に欠損していることが明らかとなった。

LHT1 の細胞内局在を明らかにするため，LHT1 の C 末端側に mGFP を融合した遺伝子を導入した形質転換体を作出した。22℃で 10 日間生育させた植物体の細胞を観察した結果， LHT1 は核に局在することが明らかになった。次に，長期高温条件下の細胞内局在を調べるために，22℃で 10 日間生育させた植物体を 37℃で 2 日間高温処理した後 GFP の観察を行った。その結果，LHT1 は核局在に加えて，細胞質において顆粒状に局在することが明らかになった。この局在様式はストレスに応答して細胞質に集積するストレス顆粒と類似していることから，LHT1 のストレス顆粒を介した翻訳調節の寄与が示唆された。

1-3. Ms-0 型 LHT1 が転写調節に及ぼす影響について
LHT1 が遺伝子発現に及ぼす影響を検証するため RNA sequencing (RNA-seq) を行った。 Col-0 と NIL_Ms-0 を用いて通常生育条件（22℃）で 10 日間生育させた植物体 (Col-0/22℃, NIL_Ms-0/22℃) と，そこから長期高温ストレス（37℃，3 日間）処理した植物体 (Col-0/37℃, NIL_Ms-0/37℃) をサンプリングし RNA を抽出した。Col-0/22℃と Col-0/37℃を比較した結果，高温誘導性遺伝子(Log2 FC > 1, FDR < 0.05) 3931 遺伝子を同定した。これらの遺伝子を GO 解析に供した結果，高温誘導性遺伝子群に加えて RNA プロセッシングに関連する遺伝子群が高温により発現誘導されることが明らかになった。同様に， Col-0/37℃ と NIL_Ms-0/37℃の比較を行った結果，NIL_Ms-0/37℃において植物免疫応答に関連する遺伝子群が発現誘導されていることが明らかになった。そこで NIL_Ms-0 と Col-0 に病原菌 Pseudomonas syringae DC3000 を接種し，病原耐性を評価した。その結果，NIL_Ms-0 は Col-0と比較して病原菌数を抑制する，すなわち病害耐性を示すことが明らかになった。このことから，Ms-0 型 LHT1 は高温応答，特に長期高温耐性の欠損を引き起こす一方，病害応答において正に働くことが示唆された。

LHT1 が RNA 結合タンパク質をコードしていること，長期高温ストレスにより RNA プロセッシング関連遺伝子群が誘導されることから，長期高温ストレスが選択的スプライシングに影響を与えること，さらに NIL_Ms-0 において選択的スプライシングに異常が生じていることが考えられた。この仮説を検証するために，RNA-seq データを用いて選択的スプライシングの検出を行った。選択的スプライシングは大別すると，エクソンスキッピング (Skipping exon; SE)・相互排他的エクソン(Mutually exclusive exons; MXE)・選択的 5’供与部位 (Alternative 5’ splice site; A5SS)・選択的 3’供与部位(Alternative 3’ splice site; A3SS)・イントロン保持(Retained intron; RI)の 5 種類に分けられる。解析の結果，5 種類全ての選択的スプライシングが長期高温ストレスにより誘導されることが明らかになった。次に，Col-0 と NIL_Ms-0 を用いて 22℃・37℃のそれぞれの条件下で比較を行った。選択的スプライシングの異常を検出するために，本来のスプライスされるはずのイントロンが残るイントロン保持に着目し解析を行った。その結果 22℃においてCol-0 で 93 遺伝子，NIL_Ms-0 で 87 遺伝子においてイントロン保持を検出することができた。一方，37℃では Col-0 で 125 遺伝子， NIL_Ms-0 で 1153 遺伝子においてイントロン保持を検出した。この結果から，LHT1 は長期高温ストレス条件下の適切な選択的スプラシングに重要であることが示唆された。

第二章 Da(1)-12 と Ei-2 を用いた高温耐性遺伝子の単離・解析
2-1. Da(1)-12・Ei-2 を用いた原因遺伝子座の同定
前述のとおり，シロイヌナズナ accession 間に見られる長期高温ストレス耐性の多様性に寄与する遺伝子座については，accession により寄与遺伝子座が異なることが考察された。耐性を示す Da(1)-12 と高感受性を示す Ei-2 については，両 accession を交雑することで作出された組替え近交系 (Recombinant Inbred Line; RIL)が存在したため，この RIL 集団を用いた QTL 解析を実施した。QTL 解析の結果，Da(1)-12 と Ei-2 間に見られる長期高温ストレス耐性の違いと相関を示す遺伝子座が，第 1 染色体上腕に座上することが示唆された。この遺伝子座は，前述の LHT1 と異なる位置に座乗したことから，当該遺伝子座を Long-term Heat Tolerance 2 (LHT2)と名付けた。LHT2 遺伝子座を同定するため，長期高温耐性を示さない Ei-2に，長期高温耐性を示さない Da(1)-12 を 5 回戻し交配することで，LHT1 遺伝子座近傍のみを Da(1)-12 由来のゲノムに置換した NIL を作出した。LHT2 遺伝子座近傍で組換えの生じた系統を探索することで，長期高温耐性を示さない NIL_Ei-2 と，長期高温耐性を示す NIL_Da(1)-12 を得た。これらの遺伝子型解析の結果，LHT2 遺伝子座を 43 kbp 内に絞り込むことに成功した。次に，Da(1)-12 と Ei-2 の間に存在する LHT2 遺伝子座の全多型を検出するため，ゲノムシークエンスに供した。その結果，LHT2 遺伝子座内の 3 遺伝子に非同義置換を検出することに成功した。Da(1)-12 とEi-2 を交雑したF1 が長期高温耐性を示すことから， Ei-2 側に劣勢突然変異が生じていると考えられる。そこで，Da(1)-12 由来の遺伝子をそれぞれクローニングし，長期高温感受性を示す NIL_Ei-2 に遺伝子導入する相補試験を行った。その結果，Da(1)-12 の 1 遺伝子を導入した NIL_Ei-2 が高温耐性を向上させることが明らかになった。LHT2 を欠損することによる影響を確認するため，Col-0 の T-DNA 挿入欠損株 (lht2-1) の耐性を評価したところ，lht2-1 変異体は長期高温耐性を示さないことが明らかになった。以上の結果より，この遺伝子が長期高温耐性の原因遺伝子，LHT2 であることが強く示唆された。

2-2. LHT2 の遺伝学的・生理学的解析
興味深いことに LHT2 は LHT1 と同様に RNA 結合タンパク質をコードする遺伝子であっ た。LHT2 は植物の病害応答や miRNA 生合成に関与する遺伝子である一方，高温ストレスをはじめとする非生物ストレス応答に関する報告はこれまでになかった。LHT2 の遺伝子欠 損変異株である lht2-1 は，植物体の矮化・扁平な葉身などの表現型が確認されている。LHT2 のプロモーター及び CDS を Da(1)-12，Ei-2 それぞれからクローニングしたものに mGFP を C 末端側に融合させたコンストラクトを作成して lht2-1 に導入することで相補試験を行った。 LHT2_Da(1)-12 あるいは LHT2_Ei-2 を導入した T2 植物は，いずれも lht2-1 の矮化をはじめ とする表現型を Col-0 と同程度に回復させたことから，LHT2_Ei-2 に存在する遺伝子多型は 長期高温耐性の欠損を生じさせるものの，植物体の生育には影響しない程度の変異であることが示唆された。

LHT2 の細胞内局在を明らかにするため，前述の LHT2-GFP を発現させた植物体を用いて観察を行った。22℃で 10 日間生育させた植物体を観察した結果，LHT2_Da(1)-12-GFP および LHT2_Ei-2-GFP はいずれも核に局在することが明らかになった。このことから， Da(1)-12・Ei-2 間に見られる LHT2 の多型は細胞内局在に影響を与えないことが示唆された。

第三章 長期高温ストレス応答に関与する遺伝子の同定
3-1. 長期高温耐性欠損株の単離
前述のシロイヌナズナaccession を用いた長期高温耐性評価の結果，広く研究に用いられる実験 accession の Col-0 は比較的高い長期高温耐性を示す accession であることが明らかとなった。そこで，LHT1，LHT2 以外の長期高温ストレス応答に関与する遺伝子の同定を目的に，Col-0 種子にエチルメタンスルホン酸 (EMS) による突然変異処理を行い，その次世代種子（M2 種子）を用いて，長期高温ストレス耐性が欠損した突然変異株のスクリーニングを行った。3000 粒の M2 種子を用いてスクリーニングを行った結果，11 系統の変異株の単離に成功し，sensitive to long-term heat (sloh) 変異株と名付けた。

3-2. 長期高温ストレス耐性欠損株 sloh4 の解析
得られた sloh 変異株のうち，sloh4 は長期高温ストレスに高感受性を示す一方，短期高温ストレス（42℃, 50 min）に対しては野生株と同等であることから，長期高温ストレス応答が特異的に欠損した変異株であることが明らかとなった。sloh4 の原因遺伝子を同定するために，Col-0 と同等の長期高温耐性を示す Da(1)-12 と sloh4 を交雑した次世代の F2 種子を用いて遺伝子マッピングを行った。マッピングの結果，sloh4 の原因遺伝子座を第 2 染色体下腕部，844 kbp 間に絞り込むことに成功した。次に sloh4 のゲノムシークエンス を行い，原因遺伝子領域のコード領域に生じた変異を検出したところ，MIP3 遺伝子の第 3 イントロン上の 3’スプライス部位にのみ変異が認められた。MIP3 が sloh4 の原因遺伝子であるか検証するために，プロモーターを含む野生型 MIP3 遺伝子を sloh4 に導入した結果，sloh4 の高温耐性が野生型と同程度に回復することが明らかとなった。さらに，MIP3 の T-DNA 挿入変異株である mip3-1 も sloh4 同様，長期高温ストレスに高感受性を示すことが明らかとなった。これらの結果より，sloh4 の原因遺伝子が MIP3 であることが強く示唆された。

MIP3 は小胞体膜上で MIP1, MIP2, MAG2 と複合体を形成し，小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送に関与することが報告されている。そこで，この複合体の長期高温ストレス耐性への関与を検証した。複合体構成因子である MIP1，MAG2 の T-DNA 挿入変異株である mip1-1, mag2-3の高温耐性評価を行った結果，これらの変異株は野生株と同等の長期高温ストレス耐性を示した。この結果より，MAG2 複合体の中で MIP3 のみが，長期高温耐性に重要な機能を持つようになったと考えられた。

MIP3 は小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送を担うため，sloh4 では小胞体（ER）ストレス応答に異常が生じていることが考えられた。この仮説を検証するために，ER ストレスのマーカー遺伝子の発現量解析を行った。その結果，ER ストレス応答における重要な転写因子である bZIP60 の発現が顕著に誘導され，同様に bZIP60 に制御される遺伝子の発現量も発現誘導されていることが明らかになった。ER ストレスセンサーである IRE1 がストレスを感知すると，bZIP60 の mRNA を細胞質でスプライシングすることで ER ストレスに対する緩和機構であるunfolded protein response (UPR)を活性化し，また IRE1 が持つ RNase 活性により標的 mRNA を分解する。長期高温ストレス耐性における IRE1 の関与を検証するため，bZIP60のスプライシングバリアントの検出と IRE1 標的遺伝子の遺伝子発現量解析を行った。その結果，長期高温条件下の sloh4 においてスプライシングされた bZIP60 の発現誘導，および IRE1 依存的 mRNA 分解標的遺伝子の発現低下が認められた。この結果から，sloh4 では長期高温条件下で IRE1 依存的な ER ストレスが過剰に誘導されていることが示唆された。

総括および考察
本研究により，植物の長期高温ストレス応答に関わる遺伝子を複数同定することに成功した。同定された遺伝子はいずれもこれまでに高温耐性に寄与するという報告はなく，これまでに明らかとなった植物の高温ストレス応答メカニズムの更なる理解につながると考えられる。一般的に植物の高温ストレス応答では，heat shock factor (HSF) を起点とした，HSPを含む幅広い高温ストレス誘導性遺伝子群の転写制御が重要とされてきた。実際に， hsfa1a/b/d/e 四重欠損体が長期高温耐性を著しく欠損することから，HSP などの発現は長期高温耐性に重要である。しかしながら，本研究で用いた Ms-0 や Ei-2 といった長期高温感受性 accession や sloh4 変異株では，野生型植物と同様に高温ストレスに応じた HSP などの発現パターンを示すことから，HSF を起点とする転写応答以外にも長期高温ストレス応答に重要な経路の存在が示唆された。本研究で行ったトランスクリプトーム解析の結果から，長期高温ストレス感受性 accession において，長期高温ストレス下で病害応答遺伝子の発現誘導が認められたこと，sloh4 変異体において ER ストレスセンサーを介した細胞死の誘導が示唆された。これらに共通することとして，長期高温ストレスに感受性を示す accession や変異株では，自発的な細胞死が亢進していることが考えられる。本研究では，sloh4 以外の高温感受性変異株の取得にも成功したことから，それらの解析を進めること，また逆に高温感受性を抑制する変異株を単離することで，長期高温ストレス応答メカニズムの詳細が明らかになると考えられる。