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摩耗軟骨片活性化マクロファージによる変形性関節症進行メカニズムの解明研究

江畑, 拓 北海道大学

2022.03.24

概要

【背景と目的】
変形性関節症（Osteoarthritis、以下 OA）は、軟骨変性を基盤とする慢性退行性関節疾患である。平均寿命の延伸によって、OA 患者は増加する一方、現時点でOA 根治する原因療法は存在しない。それゆえ、OA 原因療法を開発するために多数の OA の病態解明研究が行われているが、未だにその全貌を解明できていない。
OA の病変の首座は軟骨であるが、軟骨組織中に少数存在する軟骨細胞は軟骨代謝を営む重要な役割を担う。一方 OA において、様々なストレスによって軟骨細胞は劣化し、相対的に異化作用が亢進することで、軟骨変性を進行させる。従って、OA 軟骨細胞の劣化機序を明らかにし、その制御法を確立できれば、OA進行を抑制できる可能性がある。
近年、OA を進行させる重要な一病態として「炎症の慢性化」が挙げられる。これには、Damage-associated molecular patterns（DAMPs）で活性化したマクロファージが重要な役割を担う。関節内の DAMPs を認識し活性化したマクロファージは、多数の液性因子を介して、軟骨をはじめとする関節構成体を障害し、OAを進行させるが、その詳細な分子機序は明らかにされていなかった。そこで、我々は DAMPs 活性化マクロファージによる軟骨細胞の劣化機序を明らかにすることで、慢性炎症による OA 進行機序の一端を明らかにできると考えた。本研究の目的は、DAMPs の 1 種である摩耗軟骨片によって活性化したマクロファージが、OA の病変の首座である軟骨細胞にどのような変化を及ぼすのか、その詳細を明らかにすることである。

【対象と方法】
実験 1：摩耗軟骨片活性化マクロファージによる軟骨細胞劣化機序の解明
先行研究で確立した共培養システムを用いて、摩耗軟骨片活性化マクロファージと軟骨細胞との共培養実験を行った。48 時間共培養した後、軟骨細胞を回収し、RNA シークエンスを用いた網羅的遺伝子解析を行った。摩耗軟骨片活性化マクロファージによって軟骨細胞中に発現上昇した遺伝子を抽出し、エンリッチメント解析を含むバイオインフォマティクス解析を行った。

実験 2：OA 進行に重要である軟骨細胞新規因子「Flightless I」の同定
実験 1 の発現上昇遺伝子中から、「Flightless I」という分子を同定した。この分子の OA 軟骨に対する発現を免疫染色を用いて検討した。また、OA 関節液中にFlightless I が検出されるかどうかをウエスタンブロッティングおよび ELISA 法を用いて調べた。さらに OA 軟骨細胞の Flightless I 分泌能を調べるために、培養軟骨細胞から回収した上清中の Flightless I 量を、上記と同様の方法を用いて調べた。

実験 3：軟骨細胞、軟骨組織における Flightless I 刺激の影響
Recombinant Flightless I（rFliI）をマウス軟骨細胞およびマウス大腿骨頭軟骨組織に添加し、その影響を解析した。

実験 4：Flightless I による軟骨変性機序の解明
実験 3 で用いた In vitro 実験と同様の方法を用いて、軟骨細胞を rFliI を用いて刺激した。回収した軟骨細胞中の Mitogen-activated protein kinase（MAPK）シグナルの活性化の有無について、ウエスタンブロッティングを用いて評価した。また、rFliI と結合する軟骨細胞受容体を pull-down assay を用いて同定した。これらの結果に対して、マウス軟骨細胞を Extracellular signal-regulated kinase（ERK）1/2 シグナルの阻害剤 U0126 および Toll-Like Receptor 4（TLR4）経路の阻害剤TAK-242 でそれぞれ前治療した後、rFliI を添加した。回収した軟骨細胞において、Flightless I の効果が減弱するかどうかを検証した。

【結果】
実験 1：摩耗軟骨片活性化マクロファージによる軟骨細胞劣化機序の解明
摩耗軟骨片活性化マクロファージによって刺激した軟骨細胞では、328 個の遺伝子が発現上昇した。またこれらの発現上昇遺伝子に対してエンリッチメント解析を行い、骨化や骨石灰化、基質分解、肥大分化に関連する遺伝子群が多くみられることを明らかにした。

実験 2：OA 進行に重要である軟骨細胞新規因子「Flightless I」の同定
実験 1 の解析結果から、発現上昇遺伝子中の肥大分化や基質分解に関わる遺伝子として「Flightless I」を同定した。免疫染色により、OA 軟骨組織の表層から中間層で Flightless I の発現を確認した。また、OA 関節液中にも Flightless I が検出されており、IL-1β や TNF-α 刺激を加えた軟骨細胞の培養溶液中から同タンパクが多く検出された。

実験 3：軟骨細胞、軟骨組織における Flightless I 刺激の影響
In vitro において、rFliI 刺激は軟骨細胞の異化因子放出増加および同化因子減弱を促した。また、rFliI 刺激により軟骨細胞の肥大分化関連因子の発現が増加した。Ex vivo では、rFliI 刺激によって、軟骨表層の基質分解が促進された。

実験 4：Flightless I による軟骨変性機序の解明
rFliI 刺激軟骨細胞において、ERK1/2 シグナルの活性化がみられており、rFliIの効果は U0126 による ERK1/2 シグナルの抑制によって減弱した。また、pulldown assay によって rFliI 結合標的として軟骨細胞上の TLR4 が同定され、TAK242 による TLR4 経路の抑制により、軟骨細胞に対する rFliI の効果が減弱した。

【考察】
摩耗軟骨片活性化マクロファージによって軟骨細胞中に発現上昇した遺伝子群は、骨化や石灰化、肥大分化、基質分解に関わる遺伝子が多く含まれており、これらの変化は「軟骨内骨化」の過程に関わるものであった。過去に、過剰な力学的ストレスが軟骨細胞にかかることで、軟骨細胞の軟骨内骨化シグナルが誘導され OA 進行に寄与することが報告されている。本研究より、炎症反応によっても同様に軟骨細胞の軟骨内骨化シグナルが助長され、OA を進行させる可能性が示唆された。
また、Flightless I によって軟骨細胞中のTLR4-ERK1/2 シグナルが活性化され、軟骨細胞の肥大分化および異化作用が亢進し、OA が進行することが示された。TLR は、DAMPs などを認識するパターン認識受容体の 1 種であり、TLR 経路の活性化によって、MAPK シグナルや NF-kB シグナルが活性化される。また MAPKシグナルは、軟骨細胞の肥大分化を促進することで、異化作用を亢進することが報告されている。本結果は、TLR4-ERK1/2 シグナルが OA 進行に関連する重要なシグナルであることを示唆する結果と考えられる。

【結論】
本研究より、摩耗軟骨片活性化マクロファージは、軟骨細胞の肥大分化および異化作用が亢進させることで、OA を進行させることを示した。また、この反応系に関連する「Flightless I」という軟骨細胞新規因子を同定し、Flightless I が軟骨細胞中の TLR4-ERK1/2 シグナルを介して軟骨変性を進行させることを明らかにした。本研究は、慢性炎症による OA 進行機序の一端を解明したものである。本研究で同定した Flightless I は、OA に対する治療標的の一つと考えられる。

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