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74
Primer
Forward Primer
Reverse Primer
Runx2
5'-CGGTCTCCTTCCAGGATGGT-3'
5'-GCTTCCGTCAGCGTCAACA-3'
Col1a1
5'-AACCCGAGGTATGCTTGATCT-3'
5'-CCAGTTCTTCATTGCATTGC-3'
Alp
5'-GTTGCCAAGCTGGGAAGAACAC-3'
5'-CCCACCCCGCTATTCCAAAC-3'
Ocn
5'-GGGAGACAACAGGGAGGAAA-3'
5'-CAGGCTTCCTGCCAGTACCT-3'
Gapdh
5'-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'
5'-GGTGGTCCAGGGTTTCITA-3'
表.１
Real-time RT-PCRで用いたプライマー一覧
75
Lot
Monocyte
CD14
FITC Rat Anti-Mouse CD14
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
6133796
CD45
APC-Cy-7 Rat Anti-Mouse CD45
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
8222690
CD31
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD31
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
8192872
CD144
PE Rat Anti-Mouse CD144
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
8215572
Endothelium
表.２
Flow cytometryで用いた抗体一覧
76
Lot
Monocyte
FITC
FITC conjugated Rat IgG1, k, Isotype
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
Control
553924
APC-Cy-7
APC-Cy7 conjugated Rat IgG2b, k,
Isotype Control
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
552773
PE-Cy7
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD31
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
561410
PE conjugated Rat IgG2a, k, Isotype
BD Bioscience, Bedford, MA, USA
Control
553930
Endothelium
PE
表.３ Flow cytometryでアイソタイプコントロール
として用いた抗体一覧
77
(a)
(b)
(d)
(c)
(e)
図.1 作製したβ-TCP/ RCPハイブリッド足場
（a-c）β-TCP/ RCPハイブリッド足場のマクロ画像
足場は、直径5 mm、高さ5 mmの円柱形で作成し、中央および側面に細胞浸潤
のための連通孔を設置した。実験には半割し、直径5mm、高さ2.5mmにし供し
た。
（d-e）β-TCP/ RCP足場のSEM画像
（d）倍率40倍、（e）倍率200倍。
スケールバー:100μm
78
C57 BL/6J ♂6週齢
脛骨・腓骨
大腿骨・腸骨
増殖培地
IMDM（20% FBS,
20ng/ml FGF2, 1% P.S.）
摘出骨を乳鉢および
剪刀で細切し
骨髄細胞を回収
骨芽細胞分化培地
RPMI 1640
(20%FBS,1%P.S+
Osteoblast-Inducer Reagent)
半培地交換 全培地交換
0日 1日 2日 4日
7日
14日
２４時間後骨分化培地に半培地交換48時間後全
培地交換
図.２
培養4日、7日、14日で解析
・ALP染色
・アリザリンレッドS染色
・分化マーカー遺伝子発現
（Real-time RT-PCR)
細胞培養方法の概略図
79
(a)
(b)
対照
４日
対照
７日
対照
１４日
スケールバー:200μm
(c)
アルカリフォスファターゼ染色
＊＊
90.0
78.4
80.0
全体に対する染色領域(%)
70.0
63.2
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.3
0.0
4日
7日
14日
図.３マウス骨髄細胞の培養期間とアルカリフォスファターゼ活性の変化
80
図.３マウス骨髄細胞の培養期間とアルカリフォスファターゼ活性の変化
（a）染色したプレートのマクロ写真。
各プレートの左上のウェルは、骨分化誘導を行なって
いない対照(NC)のウェル。
（b）染色された細胞の位相差顕微鏡写真。
スケールバー：200μm 10倍
（c）ImageJを使用した染色領域の定量化。
アスタリスク１つ(*)は p <0.05、アスタリスク2つは
( **) p <0.01を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
81
対照
４日
対照
７日
対照
１４日
スケールバー:200μm
(c)
アリザリンレッドS染色
＊＊
全体に対する染色領域(%)
60.0
＊＊
46.6
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
0.0
4日
7日
0.0
14日
図.４マウス骨髄細胞の培養期間と基質形成
82
図.４マウス骨髄細胞の培養期間と基質形成
（a）染色したプレートのマクロ写真。
各プレートの左上のウェルは、骨分化誘導を行なって
いない対照(NC)のウェル。
（b）染色された細胞の位相差顕微鏡写真。
スケールバー：200μm 倍率10倍
（c）ImageJを使用した染色領域の定量化。
アスタリスク１つ(*)は p <0.05、アスタリスク2つは
( **) p <0.01を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
83
(a)
(b)
Runx2
16
12
10
7日
1.00
0.61
4日
5.62
1.00
fold increase
fold increase
14
13.88
Col1a1
14日
0.26
4日
7日
14日
(d)
(c)
Bglap
Alp
**
** 123.76
140
45.00
fold increase
fold increase
60
40
35.00
97.72
80
20
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
1.00
4日
7日
40.47
40.00
120
100
** **
14日
0.00
5.76
1.00
4日
7日
14日
図.５骨形成に関わる遺伝子のmRNA発現(４－１４日)
骨分化に関わる遺伝子マーカーのmRNA発現
培養期間による、骨形成マーカー(Runx2、Col1a1、Alp、Bglap)のリアルタ
イムRT-PCRでの発現の比較
アスタリスク１つ(*)は p <0.05、アスタリスク2つは
( **) p <0.01を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
84
4日
7日
10日
14日
85
図.6 培養細胞の位相差顕微鏡(10倍)での観察
(a)
血管内皮細胞
1.00
0.90
**
0.80
**
**
％Total
0.70
**
0.60
**
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
0日
4日
7日
14日
(b)
単球
**
**
**
％Total
**
**
0日
4日
7日
14日
(c)
図.7 マウス骨髄細胞の骨芽細胞分化培養期間による細胞の存在割合の
86
変化のFACS解析結果
図.7 マウス骨髄細胞の骨芽細胞分化培養期間による細胞の存在割合の
変化のFACS解析結果
上段から、異なる期間骨芽細胞分化培養した骨髄細胞中の血管内皮細胞(a)、
単球(b)の％Totalの変化を示す。
アスタリスク2つは( **) p <0.01を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
(c)マウス骨髄細胞の骨芽細胞分化培養期間による血管内皮細胞、単球の存在
率の変化のFACS解析で用いたパネル(代表例)
87
(a)
(b)
NB
対象群(細胞非搭載)
4日
(c)
(d)
NB
NB
14日
7日
(e)
(f)
エオジン陽性面積
30
70
25
60
20
50
細胞数
ROI中のHE陽性領域(%)
視野中の多核巨細胞数
＊＊
15
10
40
30
20
10
4日
7日
14日
4日
7日
**P<0.01
図.8
マウス背部皮下への細胞を搭載した足場の移植
14日
*P<0.05
88
図.8
マウス背部皮下への細胞を搭載した足場の移植
背部皮下に足場を移植し8週後に回収し、組織切片を作成しヘマトキシリン₋エオ
ジン染色を行い組織学的分析をおこなった。
(a)対照群（細胞非搭載）
(b)4日間の培養細胞を播種した足場
(c)7日間の培養細胞を播種した足場
(d) 14日間の培養細胞を播種した足場。
NB：再生骨の領域
スケールバー:200㎛ 10倍
(e)マウス背部皮下への細胞を搭載した足場の組織切片のエオジン陽性領域の定
量化解析
１サンプルあたり３か所のregion of interestの画像からそれぞれのサンプルの平均
値を算出後、コントロール3サンプルの平均(バックグラウンド)を引き、その後3
ロットの平均値を算出したものを表す。
アスタリスク2つは( **) p <0.01を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
(f)マウス背部皮下への細胞を搭載した足場の組織切片多角巨細胞数の定量化解
4日7日14日それぞれの切片の左、中央、右の3か所に20倍視野のregion of interest
(ROI)を3か所設定し、画像を取得した。取得した画像中の多核巨細胞数をカウン
ト、3ROIの平均値を算出し、その後3ロットの平均値を算出した。
アスタリスク1つは( *) p <0.05を示す。
エラーバーは標準誤差を示す。
89
(a)
BREGMA
骨膜
人工骨
(b)
(c)
NB
NB
NB
図.9
マウス頭蓋骨膜下への細胞を搭載した足場の移植
頭蓋骨膜下に培養7日の細胞を播種した足場を移植し組織切片を作成しヘマトキ
シリン₋エオジン染色を行い組織学的分析をおこなった。
(a):移植部位のシェーマ
(b):４倍 (c):10倍
NB：再生骨の領域
スケールバー:200㎛
90
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