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糖転移酵素を介したタンパク質糖鎖修飾の新規機能解析 (本文)

森, 研人 慶應義塾大学

2022.03.23

概要

学位論文 博士(理学)

糖転移酵素を介した
タンパク質糖鎖修飾の新規機能解析

2021 年度

慶應義塾大学大学院理工学研究科



研人

目次
第 1 章 序論

1

第 1 節 タンパク質の糖鎖修飾

1

第 2 節 Lys のグルコシルガラクトシルヒドロキシ化とその転移酵素

5

第 3 節 C 型糖修飾と DPY19 family

9

第 4 節 Fibrinogen-like protein 1

15

第 5 節 筋分化と糖鎖修飾

19

第 6 節 本研究の目的

23

第 2 章 FGL1 のグルコシルガラクトシルヒドロキシ化と
25

その糖転移酵素の同定
第 1 節 FGL1 の C 型糖修飾の有無の検証

25

第 2 節 FGL1 の グルコシルガラクトシルヒドロキシ化の検出

31

第 3 節 FGL1 のグルコシルガラクトシルヒドロキシ化の
34

糖転移酵素の同定
第 4 節 FGL1 のグルコシルガラクトシルヒドロキシ化が

41

機能に及ぼす影響
第 5 節 まとめ

47

第 2 章の実験方法

50

i

第 3 章 C 型糖転移酵素 DPY19L3 が筋分化に及ぼす影響
第 1 節 C2C12 細胞の DPY19L3 発現確認

64
64

第 2 節 DPY19L3 ノックアウトが C2C12 細胞の筋分化に
67

もたらす影響
第 3 節 DPY19L3 ノックアウトが C2C12 細胞の筋分化関連
シグナル伝達経路にもたらす影響

74

第 4 節 まとめ

76

第 3 章の実験方法

77

第 4 章 総括

87

第 1 節 研究結果の小括

87

第 2 節 考察

89

参考文献

102

附録

123

謝辞

ii

第1章

序論

第1節

タンパク質の糖鎖修飾

タンパク質は、生物の構造や機能において欠かすことができない生
体 高 分 子 の 1 種 で あ る 。タ ン パ ク 質 の 生 合 成 は 、DNA か ら mRNA へ
の 転 写 、mRNA か ら タ ン パ ク 質 へ の 翻 訳 を 経 て 行 わ れ る が 、翻 訳 直 後
のタンパク質はその構造や機能については未成熟なものが多い。タン
パク質が成熟し、正常に機能を発揮するためには、構成するアミノ酸
残基に様々な化学的修飾を受ける必要がある。これを翻訳後修飾と呼
ぶ (Fig. 1-1)。翻 訳 後 修 飾 に は 様 々 な 種 類 が 存 在 す る 。リ ン 酸 化 は タ ン
パ ク 質 の 活 性 を 制 御 す る 代 表 的 な 翻 訳 後 修 飾 で あ る [1,2]。 あ る タ ン パ
ク質が別のタンパク質をリン酸化し、そのリン酸化タンパク質がさら
にまた別のタンパク質のリン酸化を触媒するという連鎖的な反応は、
細胞内でのシグナル伝達の制御を担っている。ヒストンタンパク質の
メチル化やアセチル化は、エピジェネティックな遺伝子発現制御を行
っ て い る [3]。タ ン パ ク 質 分 子 内 や 分 子 間 で の シ ス テ イ ン の ジ ス ル フ ィ
ド結合は、タンパク質の立体構造を形作るうえで不可欠な翻訳後修飾
で あ る [4]。不 要 に な っ た タ ン パ ク 質 や 異 常 な タ ン パ ク 質 は ユ ビ キ チ ン
化 さ れ る こ と で 、 ユ ビ キ チ ン -プ ロ テ ア ソ ー ム 分 解 が 誘 導 さ れ る [5,6]。
このように、タンパク質の機能や構造について理解するためには、翻
訳後修飾についての理解が不可欠である。本論文では、翻訳後修飾の
うち、タンパク質に糖鎖が付加する糖鎖修飾に着目した。

1

Fig. 1-1 The summary of post-translational modification (PTM).

2

糖 鎖 は 、タ ン パ ク 質 や 核 酸 に 並 ぶ 第 3 の 生 命 鎖 と し て 注 目 を 集 め て
いる。糖鎖は糖の種類や結合様式の違いにより、多種多様な構造を形
成することで様々な機能を発揮する。生体機能や疾患との関係が明ら
かになりつつある糖鎖の働き、特に糖タンパク質の働きを解析するこ
とは、生命現象への理解をより深める上で欠かせないものである。
糖鎖修飾はタンパク質の安定性や分泌、フォールディングに寄与す
る こ と が 示 さ れ て い る [7–9]。 糖 鎖 修 飾 を 受 け る タ ン パ ク 質 は N 末 端
に signal peptide を 有 し 、小 胞 体 (ER) 内 に 輸 送 さ れ signal peptide が
切 断 さ れ る 。 ER 内 腔 へ の 輸 送 時 あ る い は 輸 送 直 後 の 、 翻 訳 中 も し く
は翻訳直後のタンパク質に対して糖鎖修飾は行われ、基質や糖の種類
に 対 応 し た 様 々 な 糖 転 移 酵 素 に よ っ て 触 媒 さ れ る [10–13]。そ し て 、糖
鎖修飾を受けたタンパク質は、細胞外・細胞膜などのタンパク質が機
能を発揮する器官へと輸送される。
糖 鎖 修 飾 に は 、N 型 、O 型 、C 型 、GPI ア ン カ ー 型 が 存 在 す る 。 特
に N 型 糖 鎖 修 飾 や O 型 糖 鎖 修 飾 に つ い て は 、詳 細 な 修 飾 の メ カ ニ ズ
ムや、修飾が生体機能や疾患にもたらす影響について詳細に解析が行
わ れ て い る 。例 え ば 、メ ラ ノ ー マ 細 胞 の 生 存 に N 型 糖 鎖 修 飾 が 強 く 寄
与 し て い る こ と が 、N 型 糖 鎖 修 飾 阻 害 剤 tunicamycin を 用 い た 実 験 で
明 ら か に な っ た [14]。さ ら に 、同 じ く tunicamycin に よ っ て N 型 糖 鎖
修飾を抑制すると、がん細胞における受容体型チロシンキナーゼやそ
の 下 流 に あ た る Akt シ グ ナ ル 伝 達 が 阻 害 さ れ る [15]。リ ン 酸 ホ メ オ ス

3

タ シ ス に 重 要 な Fibroblast growth factor 23 (FGF23) は O 型 糖 鎖 修 飾
さ れ る が 、 そ の 糖 転 移 酵 素 で あ る GalNac-T3 の 変 異 が 、 FGF23 の 修
飾阻害に伴うプロセシング異常を介して、遺伝性代謝疾患である家族
性 腫 瘍 性 石 灰 化 症 を 引 き 起 こ す [16]。 SARS-CoV-2 の ス パ イ ク タ ン パ
ク 質 の 糖 鎖 修 飾 の 有 無 を 質 量 分 析 で 解 析 し た と こ ろ 、 全 17 箇 所 で の
N 型 糖 鎖 修 飾 と 推 定 1 箇 所 の O 型 糖 鎖 修 飾 が 検 出 さ れ 、ウ イ ル ス 感
染のメカニズム解明や、ワクチンや治療薬開発へ役立てられることが
期 待 さ れ て い る [17]。ま た 、N 型 や O 型 よ り は 少 な い も の の GPI ア
ン カ ー 型 糖 鎖 修 飾 と 疾 患 の 関 係 も 報 告 さ れ て い る 。GPI に 対 す る 糖 転
移 酵 素 の 1 つ で あ る PIGA の 体 細 胞 変 異 は 、 自 然 免 疫 の 攻 撃 対 象 と
なる異常な赤血球が出現する、発作性夜間ヘモグロビン尿症を引き起
こ す [18]。 こ の よ う に 、 が ん や 感 染 症 な ど の 様 々 な 疾 患 の 原 因 に 糖 鎖
修飾が関連している場合もあり、糖タンパク質は病因究明や治療法の
開発においても注目されている。
本論文では様々な種類がある糖鎖修飾の中から、O 型糖鎖修飾の 1
種 で あ る Lys の グ ル コ シ ル ガ ラ ク ト シ ル ヒ ド ロ キ シ 化 、そ し て C 型
糖 修 飾 (C-mannosylation) に 注 目 し た 。

4

第2節

Lys の グ ル コ シ ル ガ ラ ク ト シ ル ヒ ド ロ キ シ 化 と そ の 転 移 酵 素

Lys の グ ル コ シ ル ガ ラ ク ト シ ル ヒ ド ロ キ シ 化 (GGH) は 、 ま ず Lys
の 5 位 に ヒ ド ロ キ シ 基 が 付 加 し 、 続 い て b-galactose が C1 位 で ヒ ド
ロ キ シ 基 と 脱 水 縮 合 す る 。そ し て 1,2-グ リ コ シ ド 結 合 で a-glucose が
付 加 す る 糖 鎖 修 飾 の 1 種 で あ る [19,20]。 ヒ ド ロ キ シ 化 し た Lys (Hyl)
に 対 し て 酸 素 原 子 を 介 し て 糖 鎖 が 付 加 す る こ と か ら 、O 型 の 糖 鎖 修 飾
に 分 類 さ れ る 。1935 年 、collagen で 2 つ の hexose が 付 加 し て い る こ
と が 初 め て 確 認 さ れ た [21]。そ の 後 の 解 析 に よ り 、付 加 し て い る hexose
の 種 類 が glucose と galactose で あ る こ と や 、 詳 細 な 結 合 様 式 が 明 ら
か に な っ た [20] (Fig. 1-2)。GGH を 受 け る 基 質 タ ン パ ク 質 と し て 、前 述
の collagen や adiponectin、Mannan-binding lectin (MBL) [22–24]な ど の
collagen-like domain を 有 す る も の が こ れ ま で 報 告 さ れ て き た 。
Collagen-like domain は Xaa-Xaa-Gly (Xaa: 任 意 の ア ミ ノ 酸 ) の 繰 り 返
し 構 造 で 構 成 さ れ て お り 、 そ の う ち Gly の 直 前 が Lys の と き 、 そ の
Lys が GGH さ れ る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。
GGH は 複 数 の 酵 素 に よ っ て ヒ ド ロ キ シ 基 及 び 糖 の 付 加 が 行 わ れ る 。
ま ず 、 lysyl hydroxylase (LH) 1, 2, 3

(EC 1.14.11.4) が Lys 側 鎖 の ヒ ド

ロ キ シ 化 を 行 う [25,26]。LH に よ る ヒ ド ロ キ シ 化 は 、ド ナ ー と し て aケ ト グ ル タ ル 酸 、補 因 子 と し て Fe 2+ と L-ア ス コ ル ビ ン 酸 を 必 要 と す
る [27]。 続 い て 、 collagen galactosyltransferase 1, 2 (GLT25D1, D2) (EC
2.4.1.50)が 、糖 供 与 体 と し て UDP-galactose、補 因 子 と し て Mn 2+ を 用

5

い て ガ ラ ク ト シ ル 化 を 触 媒 す る [28–30]。最 後 に 、hydroxylase 活 性 だ け
で な く 、glucosyltransferase 活 性 を 持 つ LH3 が 、UDP-glucose と Mn 2+
を 用 い て グ ル コ シ ル 化 を 触 媒 す る (EC 2.4.1.66)[26,28,29]。 LH3 は 二
量体を形成し、N 末端に糖転移酵素の活性部位を、C 末端に
hydroxylase の 活 性 部 位 を 有 し て い る [31]。 LH family と GLT25D1 は
い ず れ も ER に 局 在 し て い る [32,33]こ と か ら 、GGH は ER で 行 わ れ
ていると考えられる。
GGH や 、GGH の 糖 転 移 酵 素 の 発 現 が 生 体 機 能 に も た ら す 影 響 に つ
い て は 複 数 報 告 が 挙 が っ て い る 。Collagen で は 、架 橋 や 三 重 ら せ ん 構
造 の 形 成 、お よ び 線 維 形 成 に GGH が 重 要 で あ る [12,19]。Collagen の
GGH が 過 剰 に 起 こ る と 、collagen 異 常 症 の 1 種 で あ る 骨 形 成 不 全 症
が 引 き 起 こ さ れ る [19,34]。 Insulin 感 受 性 ホ ル モ ン で あ る adiponectin
は 多 量 体 形 成 に よ っ て AMPK 経 路 を 活 性 化 さ せ る が 、 そ の 多 量 体 の
安 定 化 に GGH が 重 要 で あ る [22]。MBL で 見 ら れ る GGH の う ち 、ヒ
ド ロ キ シ 化 と glucose 付 加 を LH3 が 触 媒 す る が 、 LH3 に よ る
glucose 付 加 が MBL の 多 量 体 形 成 能 に 重 要 で あ る [24]。 こ の よ う に 、
GGH が 基 質 タ ン パ ク 質 や 生 体 機 能 に も た ら す 影 響 に つ い て は あ る 程
度解析が進んでいる。しかし、これらのタンパク質はいずれも
collagen-like domain を 有 し て お り 、こ の ド メ イ ン を 持 た な い タ ン パ ク
質 で の GGH や 、そ の 機 能 解 析 に つ い て は こ れ ま で 行 わ れ て い な か っ
た。

6

し か し 近 年 、 cellular communication network factor 1 (CCN1) タ ン パ
ク 質 に お い て 、 Lys 203 で GGH と 思 わ れ る 修 飾 が collagen-like domain
を 有 し て い な い に も か か わ ら ず 確 認 さ れ た [35]。 さ ら に 、 こ の 修 飾 に
お い て 、 2 番 目 の 糖 付 加 を LH3 が 触 媒 す る こ と が 明 ら か に な り 、 こ
の 糖 が glucose で あ る こ と が 示 さ れ た 。さ ら に 、Lys 203 を Arg に 置 換
し た 、 GGH が 起 こ ら な い 変 異 体 を 用 い た 解 析 に よ っ て 、 発 見 さ れ た
GGH と み ら れ る 糖 鎖 修 飾 が CCN1 の 分 泌 に 重 要 で あ る こ と が 示 さ
れ た 。し か し 、Hyl 203 に 最 初 に 付 加 す る 糖 の 種 類 の 同 定 を 行 っ て い な
い た め 、 GGH で あ る か 否 か の 詳 細 な 検 証 に は 至 ら な か っ た 。 ま た 、
collagen-like domain を 持 た な い タ ン パ ク 質 に お け る GGH の 正 式 な
報告例やその転移酵素の同定はこれまで行われていない。このことか
ら 、collagen-like domain を 有 し な い タ ン パ ク 質 に お け る GGH に つ い
て解析を行うには、新たな基質タンパク質の探索が求められる。

7

Fig. 1-2 The structure of glucosyl-galactosyl-hydroxylysine.

8

第3節

C 型 糖 修 飾 と DPY19 family

C 型 糖 修 飾 は 、 Trp 残 基 の イ ン ド ー ル 環 2 位 の 炭 素 と a-mannose
の C1 原 子 が 結 合 す る 、 極 め て ユ ニ ー ク な 糖 修 飾 で あ る (Fig. 1-3)。
Hofsteenge ら は 1994 年 、 ヒ ト RNase2 に お い て 初 め て C 型 糖 修 飾
を 発 見 し た [36]。タ ン パ ク 質 が C 型 糖 修 飾 さ れ る 条 件 と し て 、N 末 端
に 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 が 豊 富 な signal peptide を 有 す る こ と 、consensus 配
列 と し て Trp-Xaa-Xaa-Trp/Cys (Xaa: 任 意 の ア ミ ノ 酸 ) を 持 つ こ と が
知 ら れ て い る [37]。 こ の consensus 配 列 に お い て N 末 端 側 の Trp が
C 型糖修飾される。しかしながら、これらの条件を満たしているにも
関わらず C 型糖修飾が確認されなかったタンパク質も存在しており、
よ り 詳 細 な 条 件 の 存 在 が 示 唆 さ れ て い る 。ま た 、現 在 C 型 糖 修 飾 が 報
告 さ れ て い る タ ン パ ク 質 の 数 は 約 30 と 、 他 の 糖 鎖 修 飾 と 比 較 す る と
非 常 に 少 な い [38] 。 そ の 約 30 の う ち 、 thrombospondin type-1 repeat
(TSR) や Type-1 cytokine receptor と い っ た 特 定 の ド メ イ ン で C 型 糖
修飾が発見される場合が多くを占めている。これらのドメインでは上
記 の C 型 糖 修 飾 の consensus 配 列 が 高 度 に 保 存 さ れ て い る 。 C 型 糖
修 飾 が 報 告 さ れ て い る タ ン パ ク 質 の 例 を Table 1-1 に 示 す [13,36,47–
56,39,57–60,40–46]。

9

Fig. 1-3 The structure of C-mannosyltryptophan.

10

Table 1-1 C-mannosylated proteins.
C-mannosylated protein

Type

R-spondin 1-3
Spondin 1,2
RPE-spondin
Human complement system
(C6, C7, C8α, C8β, C9)

Thrombospondin

Netrin receptor (UNC5A)

type-1 repeat

Thrombospondin 1

(TSR)

Properdin
ADAMTS 4,5,13
ADAMTS-like protein 1
Isthmin 1
Interleukin-21 receptor
Thrombopoietin receptor (c-Mpl)
Granulocyte colony-stimulating factor
receptor (G-CSFR)

Type I
cytokine
receptor

RNase 2
Mucin-5AC, 5B
IL-12 subunit β
Hyaluronidase-1
Lipoprotein lipase (LPL)
Myelin-associated glycoprotein
Microfibril-associated glycoprotein 4
(MFAP4)

11

Other

C 型 糖 修 飾 の 機 構 は Fig. 1-4 の よ う だ と 予 測 さ れ て い る [61]。 ま ず 、
dolichol kinase (DOLK) が 小 胞 体 (ER) 膜 上 の dolichol に cytidine triphosphate (CTP) か ら リ ン 酸 基 を 転 移 さ せ 、 dolichol phosphate (Dol-P)
を 生 成 さ せ る 。 次 に 、 dolichol phosphate mannosyltransferase (DPM) 複
合体が

guanosine di-phosphate (GDP) - mannose か ら

Dol-P に

mannose を 転 移 さ せ 、 dolichol phosphate mannose (Dol-P-Man) が 生 成
す る 。 Dol-P-Man は 未 だ 同 定 さ れ て い な い flippase に よ っ て ER 膜
上 で 反 転 し 、 mannose が ER 内 腔 側 を 向 く 。 こ の mannose の 基 質 タ
ン パ ク 質 へ の 転 移 を C 型 糖 転 移 酵 素 (C-mannosyltransferase) が 触 媒
す る 。2013 年 、Buettner ら は 、線 虫 の dpy19 が C 型 糖 転 移 酵 素 と し
て の 活 性 を 有 す る こ と を 初 め て 明 ら か に し た [62]。Dpy19 は 、N 型 糖
鎖 修 飾 に お け る 糖 転 移 酵 素 複 合 体 OST に お い て 中 心 的 な 役 割 を 担 う
Stt3 と 膜 貫 通 構 造 が 類 似 し て い る 点 か ら 、糖 転 移 酵 素 と し て の 活 性 を
持つことが予測されたことが経緯で、 C 型糖転移酵素として同定さ
れ た [62]。

12

Fig. 1-4 Putative mechanism of C-mannosylation.

13

Dpy19 の 哺 乳 類 の ホ モ ロ グ と し て DPY19 family (DPY19L1~L4) が
存 在 し 、い ず れ も ER 膜 上 で 発 現 す る 複 数 回 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 で あ る 。
DPY19L1 は 、 大 脳 皮 質 の 発 生 に お い て 興 奮 性 神 経 細 胞 の 移 動 や 神 経
突 起 の 伸 長 を 制 御 す る [63,64]。DPY19L2 は 精 巣 特 異 的 に 発 現 し 、そ の
欠 損 が 巨 大 頭 部 精 子 症 の 原 因 で あ る こ と が 示 さ れ て い る [65]。さ ら に 、
International Mouse Phenotyping (IMPC) に よ る と 、 DPY19L1 を KO し
た マ ウ ス で は 、そ れ ぞ れ 死 亡 率 ・ 老 化 ・ 血 管 系 へ の 異 常 が 、 DPY19L3
KO マ ウ ス で は 代 謝 ・ 免 疫 ・ 赤 血 球 数 に つ い て の 異 常 が 報 告 さ れ て い
る 。こ の DPY19 family の う ち 、DPY19L1 お よ び DPY19L3 が 、そ れ
ぞれハムスターとヒトについて C 型糖転移酵素としての活性を持つ
こ と が 示 さ れ た [13,39]。 DPY19L3 は 膜 貫 通 構 造 の 解 析 が 行 わ れ て い
る [66]。 ...

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参考文献

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Sekine M, Obayashi M, Nishi T, Shibahara T, Tanaka T, Ishii S,

Yamamoto J ichi, Saito K, Kawai Y, Isono Y, Nakamura Y, Nagahari

K, Murakami K, Yasuda T, Iwayanagi T, Wagatsuma M, Shiratori A,

Sudo H, Hosoiri T, Kaku Y, Kodaira H, Kondo H, Sugawara M,

Takahashi M, Kanda K, Yokoi T, Furuya T, Kikkawa E, Omura Y, Abe

K, Kamihara K, Katsuta N, Sato K, Tanikawa M, Yamazaki M,

Ninomiya K, Ishibashi T, Yamashita H, Murakawa K, Fujimori K,

Tanai H, Kimata M, Watanabe M, Hiraoka S, Chiba Y, Ishida S, Ono

120

Y, Takiguchi S, Watanabe S, Yosida M, Hotuta T, Kusano J, Kanehori

K, Takahashi-Fujii A, Hara H, Tanase T o., Nomura Y, Togiya S,

Komai F, Hara R, Takeuchi K, Arita M, Imose N, Musashino K, Yuuki

H, Oshima A, Sasaki N, Aotsuka S, Yoshikawa Y, Matsunawa H,

Ichihara T, Shiohata N, Sano S, Moriya S, Momiyama H, Satoh N,

Takami S, Terashima Y, Suzuki O, Nakagawa S, Senoh A, Mizoguchi

H, Goto Y, Shimizu F, Wakebe H, Hishigaki H, Watanabe T, Sugiyama

A, Takemoto M, Kawakami B, Yamazaki M, Watanabe K, Kumagai A,

Itakura S, Fukuzumi Y, Fujimori Y, Komiyama M, Tashiro H,

Tanigami A, Fujiwara T, Ono T, Yamada K, Fujii Y, Ozaki K, Hirao

M, Ohmori Y, Kawabata A, Hikiji T, Kobatake N, Inagaki H, Ikema Y,

Okamoto S, Okitani R, Kawakami T, Noguchi S, Itoh T, Shigeta K,

Senba T, Matsumura K, Nakajima Y, Mizuno T, Morinaga M, Sasaki

M, Togashi T, Oyama M, Hata H, Watanabe M, Komatsu T,

Mizushima-Sugano J, Satoh T, Shirai Y, Takahashi Y, Nakagawa K,

Okumura K, Nagase T, Nomura N, Kikuchi H, Masuho Y, Yamashita

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122

附録

Table S-1 Cell numbers to calculate fusion index.

Parent

DPY19L3-KO

Nuclei in polynuclear cells

149

69

140

15

14

All Nuclei

406

201

294

97

169

171

123

謝辞

本研究は、著者が慶應義塾大学大学院 生物化学研究室在籍時に、同理工学

部 清水史郎教授のご指導のもと行いました。研究遂行にあたり、実験結果や論

文の内容について日常的にディスカッションを重ねてくださったお陰です。ここ

に厚く御礼申し上げます。

本論文の執筆にあたり、慶應義塾大学理工学部 末永聖武教授、宮本憲二教

授、松本緑准教授に数多くの貴重なご意見をいただきました。心より感謝申し上

げます。

タンパク質の糖鎖修飾の検出にあたり、質量分析を行ってくださった、国

立研究開発法人 理化学研究所 環境科学研究センター 生命分子解析ユニットの

堂前直博士、鈴木健裕博士に、心より御礼申し上げます。

本研究の遂行にあたり、的確なご指導、ご鞭撻、ご助言を賜りました、東

京工業大学 化学生命科学研究所 三浦一輝博士に深く感謝いたします。

常日頃から実験についてご指摘やアドバイスをしてくださった、生物化学

研究室の先輩方、同期、後輩に心から感謝いたします。皆様が作り上げた研究室

の温かい雰囲気に支えられて、ここまで研究を続けることができました。

最後に、毎日の研究室生活を支えてくれた家族に、深く感謝いたします。

...

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