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Conformational change of RNA‐helicase DHX30 by ALS/FTD‐linked FUS induces mitochondrial dysfunction and cytosolic aggregates

Hikiami, Ryota 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k24319

2023.01.23

概要

FUS 遺伝子はRNA 結合タンパク質をコードし、その遺伝子変異は筋萎縮性側索硬化症
（ALS）を引き起こす。本邦の家族性 ALS では 2 番目に頻度が高く、孤発性 ALS では最も頻度が高い。ALS-FUS 患者の病理は、FUS の核から細胞質への異所性局在と、FUS陽性細胞質内凝集体が特徴で、過去の動物実験等より毒性獲得説が有力と考えられている。液―液相分離を介した凝集体形成が近年注目されているが、その病態機序は未だ不明である。加えてミトコンドリア障害はALS-FUS の病態機序において有力な候補の一つだが、変異型FUS がミトコンドリア機能障害をどのように引き起こすかは明らかにされていない。

FUS 結合タンパク質を同定するため、野生型・変異型FUS を発現する培養細胞を用いて、免疫沈降と質量分析を行い、同定された候補より主にミトコンドリアに局在するRNAヘリカーゼであるDHX30 に着目した。DHX30 はミトコンドリアマトリックス内でRNA顆粒を構成し、ミトコンドリアリボソームの形成に関与し、ミトコンドリアDNA 由来のタンパク質の翻訳に重要な機能を有する。培養細胞でDHX30 発現を抑制すると酸化的リン酸化複合体の形成障害を来し、ノックアウトマウスは周産期に死亡する。さらにその遺伝子変異例は神経発達障害を有する患者で報告されており、神経細胞において重要な機能を担っていると推察される。本研究では、DHX30 がALS-FUS の病態機序において鍵分子となりうる可能性を示した。

免疫沈降で、野生型・変異型FUS は共にDHX30 とRNA 依存性に結合する事を示した。免疫蛍光染色で、野生型FUS はDHX30 のミトコンドリア局在に影響を与えなかったが、変異型FUS はミトコンドリア内のDHX30 のシグナルを低下させ、FUS 陽性細胞質内凝集体でDHX30 やストレス顆粒マーカーと共局在した。 ALS-FUS 患者の脊髄の免疫化学染色でも、運動ニューロン内のFUS 陽性凝集体における共局在を認め、免疫電子顕微鏡ではミトコンドリア内のDHX30 シグナルの減少が観察された。さらに変異型FUS 発現細胞でDHX30 は不溶性分画へ移行し、密度勾配超遠心法では細胞質分画への一部移行が確認された。またDHX30 が変異型FUS 陽性細胞質内凝集体へリクルートされ、凝集体形成を促進することも明らかにした。

興味深いことに、細胞小器官分画成分のウェスタンブロット法解析では、変異型 FUS発現細胞におけるミトコンドリア内のDHX30 の総量は明らかな減少を認めず、免疫染色解析での変化は、ジスルフィド結合の形成異常を介したDHX30 の構造障害が原因と判明した。この構造障害は酸化ストレスと相関せず、さらにミトコンドリアストレス、小胞体ストレス、プロテアソーム阻害等の誘発刺激では認めないことから、変異体 FUS と DHX30 の相互作用がDHX30 の構造障害を引き起こしていると考えられた。さらにパルスラベル実験でミトコンドリアでの翻訳阻害を認め、ブルーネイティブゲル電気泳動で酸化的リン酸化複合体の形成障害を認めた。これらはDHX30 遺伝子発現抑制細胞と類似しており、変異型FUS がDHX30 の構造障害から機能喪失を引き起こし、ミトコンドリア障害を来したと推察された。

これらの結果から、DHX30 はジスルフィド結合の形成異常による構造障害を介して、 ALS-FUS におけるミトコンドリア機能障害と細胞質凝集体形成に関与する、極めて重要な分子である可能性が示唆された。

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