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皮膚の色素沈着形成における真皮血管系の寄与

柴田, 貴子 東京大学 DOI:10.15083/0002004171

2022.06.22

概要

１．序論
皮膚は、外部環境と内部環境の間の障壁として、身体の恒常性維持における重要な機能をもつ。例えば、メラニン産生細胞はメラニン生成により、紫外線を吸収するといった役割を果たす。しかしメラニン生成が過剰になれば、老人性色素斑や肝斑といった色素異常症を引き起こす。色素異常症の改善のためには、古くはメラニン生成の機構解明が中心であり、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を制御することがもっとも有効な手段であると考えられていた。しかし、チロシナーゼ活性や紫外線照射によるメラニン生成亢進機序をターゲットとした治療法は対症療法に過ぎないため、色素異常症を本質的に改善するためには、色素沈着異常を引き起こしている要因を突き止めることが重要であった。

老人性色素斑や肝斑は、慢性的な紫外線曝露による皮膚の光老化が主な原因であり、紫外線照射によって生じる現象に着目した色素沈着部位と非病変部位における差異を見出す研究は盛んに行われてきた。それらは、過去には表皮内の機構に着目したものが多かったが、近年、真皮からの作用についての報告も増えてきており、特に毛細血管の関与が注目されつつある。そこで、私は皮膚色素沈着形成における血管の関与メカニズム解明を行うこととした。

２．本論
２－１老人性色素斑における血管構造解析
まずは色素沈着部位における血管の状態を把握することが必要である。これまでに我々は、老人性色素斑において、真皮上層での毛細血管の占める面積が、周辺の正常部位に比べ増加していることを報告している。しかしながら、既存研究は皮膚薄層切片の二次元的な解析であり、血管系が増加していることまではわかっても、血管の立体構造については解明できていなかった。そこで本研究では、規模の大きい皮膚組織全体を観察することにより、病変部位の血管構造を三次元で捉えることを試みた。顔面に老人性色素斑を有する被験者から取得した皮膚組織を血管内皮細胞マーカーにて免疫染色後、透明化処理を行い、ライトシート顕微鏡により画像取得した。

3D画像観察の結果、正常部位では毛細血管は比較的均一な太さで規則正しく配向していたが、病変部位では細く分岐の多い血管が密集しているという部位が存在する点で明らかな形態学的な変化を示していた。定量解析では、老人性色素斑部位は血管の占める容積および血管分岐数の有意な増加が示された。

血管は、マクロファージのような炎症細胞の浸潤を促進し、皮膚の炎症において重要な役割を果たす。実際、我々は過去に、マクロファージ数が老人性色素斑における有意な増加を報告している。また、血管内皮増殖因子VEGF-Aを発現したマクロファージが老人性色素部位に多く存在していることも見出しているため、色素沈着部位における血管系増加とマクロファージの関連も示唆されている。そこで次に老人性色素斑におけるマクロファージ浸潤の程度と血管との関連を見出すため、血管内皮細胞マーカーおよびマクロファージマーカーを用いた二重免疫蛍光解析を行った。その結果、CD68陽性マクロファージが複雑に分岐した血管構造領域に密集していた。つまり、マクロファージの浸潤が老人性色素斑で特徴的な血管構造形成と関連している可能性が示唆された。

ここまでの研究により、老人性色素斑病変部位では、おそらく慢性的な紫外線曝露を経て、マクロファージの血管周辺への誘因、及び血管新生の亢進などを引き起こし、最終的に構造的に異常な血管構造を形成していることが示唆された。しかしこのような血管構造変化が色素沈着形成のプロセスにおいて何らかの役割を持つのかについては不明であった。そこで、次に血管系の異常と色素沈着形成の関連について解析することとした。

２－２血管内皮細胞のメラニン生成亢進メカニズム解明
一般的に、紫外線曝露による皮膚の色素沈着形成には、メラノサイトの周辺細胞からの分泌因子による作用によって引き起こされる。ケラチノサイトではαMSH、エンドセリン１（ET1）などがメラニン生成における主要な因子として知られている。一方、線維芽細胞は紫外線曝露により細胞老化を引き起こし、SCFやsFRP2といった因子が分泌されることが知られている。これらの因子は紫外線により一過的にその分泌を増加させるだけでなく、老人性色素斑や肝斑においては慢性的に発現が亢進していることも知られている。

前述のとおり私は老人性色素斑では構造的に異常な血管構造を形成していることを見出している。そこで、血管内皮細胞もケラチノサイトや線維芽細胞と同様に、紫外線曝露による色素沈着形成における役割を担っているのではないかと考え、紫外線刺激を加えた血管内皮細胞のメラニン生成における作用を検討した。

紫外線照射したヒト真皮毛細血管内皮細胞（HDMEC）培養上清存在下で皮膚組織を3日間培養し、組織切片の観察を行った結果、メラニン蓄積の有意な亢進が見られた。つまり紫外線照射を受けた血管内皮細胞からは、メラニン生成を促進する因子が分泌されている、または抑制作用を持つ因子の分泌量が低下している可能性が考えられた。そこで次に、血管内皮細胞から分泌されるメラニン生成に関わる因子の同定を試みた。

因子同定のため、紫外線照射及び非照射HDMECよりmRNAを抽出し、HiSeq2500にてシークエンシングしたのち、遺伝子発現プロファイルを比較した。統計解析の結果、28の紫外線照射により発現亢進を示す遺伝子、103の発現低下を示す遺伝子を見出した。一般的にメラニン生成亢進に関与することが知られているET1、POMC、bFGF、メラニン生成に抑制的な因子であるTGF-β、IL-6、IFN-γは発現プロファイルに大きな違いはなかった。一方で、SCFは有意に増加していることが確認できた。これまでSCFは老化した線維芽細胞から分泌されメラニン生成を亢進することが報告されていたが、本結果から、紫外線により活性化した血管内皮細胞からも分泌されメラニン生成を促進することが示唆された。

そこで次にSCF受容体c-Kitの特異的阻害剤、及びSCF中和抗体を用いてSCFの機能解析を行った。紫外線照射したHDMEC培養上清をメラノサイトに加え、同時に阻害剤またはSCF中和抗体を添加したところ、いずれの場合も培養上清により亢進したメラニン生成が抑制されることを見出した。つまり紫外線照射された血管内皮細胞から分泌する因子のうち、SCFはメラニン生成を促進する主要な因子であることが示唆された。

次に肝斑患者より病変部位と非病変部位を採取し、血管内皮細胞由来のSCFの色素異常症における生体での役割を調べた。病変部位ではSCFの発現量が増加しており、更に血管内皮細胞マーカーとSCFの共発現している細胞が観察された。以上より、invivoにおいても血管由来のSCFが存在しており、シミ形成における関与が示唆された。

以上から、血管内皮細胞が紫外線暴露により活性化されると主にSCFなどのメラニン生成促進因子が分泌される機構が存在し、これがおそらく慢性的な日光暴露によって形成される色素沈着の一因となっていることが示唆された。

２－３経皮投与におけるトラネキサム酸（TA）の色素沈着改善効果と血管系への作用の検証止血剤・抗炎症剤として知られているTAは、古くから内服での肝斑への効能が確認されており、臨床で使用されている医薬品である。肝斑改善における作用機序はメラノサイトを活性化するプラスミンの作用を抑えることが知られていたが、それだけでは説明がつかず、最近ではTA（内服）により真皮の血管数が減少することが報告されている。そこで、我々は化粧品の投与経路である経皮におけるTAの色素沈着改善効果と血管系への作用の有無を検証した。

皮膚科専門医の判定による肝斑スコア、及び分光測色計による明度指数L*、紅斑指数a*の指標において改善が見られ、色素沈着改善効果が確認できた。事前に同意を得た一部の被験者からは、試験開始前と連用後に被験部位の皮膚組織を採取し、免疫組織染色により作用メカニズム解析を行った。経皮でのTA投与により、CD31陽性血管内皮細胞の減少及び表皮に発現しているVEGF-Aについても発現が減少した。しかし、血管内皮細胞やVEGF発現の減少効果における統計的有意差は見られなかった。一方、色素沈着部位で高発現することが知られている表皮ET1に関しては有意に減少することを見出した。今回の検証では、TAの経皮適用であり、基本的に有害事象が生じない用量用法の範囲内であったため、表皮への作用は確認できたが、真皮への作用は限定的であったことが考えられる。しかしながら、TAの経皮適用においても血管系への作用のポテンシャルがあることを確認できたため、今後はより深部へ到達させることにより、血管系への作用をはっきりと見出せる可能性が示唆された。

３．総括
以上より私は、色素沈着部位では真皮に異常な血管構造が形成されていること、紫外線により活性化された血管内皮細胞から分泌される因子がメラノサイトでのメラニン生成を促進すること、その主要な因子はSCFであることを見出した。また経皮投与でのTAの色素沈着改善効果は、血管への作用もひとつの作用であることが示唆された。本知見は、本質的なシミ改善に向けた治療法の開発への切り口となることが期待され、今後は血管系が亢進している意義についての更なる研究が求められる。

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