ミトコンドリア病の診断における呼吸鎖複合体Vの生化学的評価

概要

【序文】
ミトコンドリアは生体の主要なエネルギーであるATPを産生する重要な細胞内小器官である。ATP合成の場となる呼吸鎖複合体は、ミトコンドリア内膜上に存在するタンパク複合体で、電子を伝達しながら膜の内外にプロトン勾配を形成する電子伝達系（複合体I～IV）と、そのプロトン勾配を利用してATP合成を行うATP合成酵素（複合体V）から構成される。ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの何らかの機能異常により、神経や筋を中心とした多臓器に多様な症状をきたす疾患群である。ミトコンドリア病の原因は様々だが、中でも呼吸鎖複合体の異常によるものが最多である。したがってミトコンドリア病の診断のためには遺伝学的解析、筋病理診断等と並んで、呼吸鎖複合体の生化学的評価が重要である。呼吸鎖複合体の評価としては、酵素として働く各複合体の酵素活性測定や、Blue native PAGE（BN-PAGE）を用いた複合体の量・構造の評価などが行われる。BN-PAGEとは、タンパクを変性させずに電気泳動を行うnative-PAGEの手法の1つであり、検体を色素で処理することにより、複合体構造を保ったままのタンパクを大きさに応じて負に荷電させて泳動・分離できるため、特に呼吸鎖複合体のような膜タンパクの評価に適した方法である。

呼吸鎖複合体V欠損症は複合体V（F1-FoATP合成酵素）の異常による疾患で、呼吸鎖複合体の異常の中では比較的まれである。特徴的な症候群を呈する症例もあるが、臨床症状は非特異的かつ多彩である。複合体Vを構成する多数のサブユニットはミトコンドリアDNA（mtDNA）、核DNAの双方にコードされているが、複合体V欠損症の原因としてはmtDNA上のMT-ATP6およびMT-ATP8の変異によるものが大多数を占める。

複合体Vの酵素活性測定は技術的な困難もあり確立しておらず、呼吸鎖複合体の酵素活性測定の対象は複合体IからIVまでに限られることが多い。また診断の際に呼吸鎖複合体のBN-PAGEまで施行されることは一般的でない。このためミトコンドリア病を疑った場合にも複合体Vについて評価されることは稀であり、複合体V欠損症の一部は診断に至らず、病態の解明が不十分となっている可能性がある。

【目的】
本研究の目的は、呼吸鎖複合体V欠損症例を適切に診断するために、BN-PAGEと酵素活性測定により複合体Vの異常を検出できるか検討することと、これらの解析を通して複合体V欠損症の病態を解明することである。

【方法】
1999年から2015年の期間にミトコンドリア病等の疑いのために筋生検がなされ、国立精神・神経医療研究センターに骨格筋検体が送付された症例のうち、mtDNA解析にてMT-ATP6あるいはMT-ATP8に変異またはバリアントが同定され、なおかつ培養細胞が利用可能であった17症例を対象とした。これらの患者由来筋芽細胞・皮膚線維芽細胞および凍結筋組織から抽出したミトコンドリア分画を用いて、呼吸鎖複合体のBNPAGEと酵素活性測定を行った。複合体Vの酵素活性としてATP合成反応を直接測定するためには、新鮮骨格筋を試料としてミトコンドリア内膜が維持された状態で測定する必要があり技術的に困難なため、本研究では逆反応であるATP加水分解の活性を測定した。本症の原因として最も多いm.8993T>G/C変異を有する6症例についてはパイロシークエンスによりmtDNAの変異率測定を行った。

【結果】
症例は17例で、男8例、女9例であった。小児期の発症が多く、ほとんどは2歳以前に発症していた。臨床診断はLeigh脳症、ミトコンドリアミオパチー、失調、慢性進行性外眼筋麻痺であり、神経筋症状が主症状であったが、そのほかの多臓器に合併症を有する例が多かった。mtDNAの変異の内訳は、MT-ATP6上の変異が15例（m.8950G>A（1例）、m.8969G>A（1例）、m.8993T>G（4例）、m.8993T>C（2例）、m.9035T>C（1例）、m.9139G>A（1例）、m.9155A>G（2例）、m.9173T>C（1例）、m.9176T>C（1例）、m.9185T>C（1例））、MT-ATP6/8オーバーラップ領域の変異が2例（m.8528T>C（1例）、m.8529G>A（1例））であり、このうち病原性が確立している変異が7種類（11例）、報告はあるが病原性未確定のバリアントが3種類（3例）、未報告のバリアントが2種類（3例）であった。

BN-PAGEでは、筋芽細胞ミトコンドリアを用いた場合は17例中4例、骨格筋ミトコンドリアを用いた場合は17例中11例で、完全型複合体V（holo complex）の減少や、分子量の小さい異常なsubcomplexを検出した。holo complexとsub complexの比率は症例により不定であった。一部の症例では皮膚線維芽細胞についても解析し、筋芽細胞と同様の結果を得た。m.8993T>G/C変異例での変異率は、筋芽細胞で54～100%、骨格筋で76～100%であった。ATP加水分解活性測定では、筋芽細胞でも骨格筋でも有意な活性低下を示した例はなかった。

【考察】
臨床像は多彩であり、ミトコンドリア病に矛盾しないものであったが、症状や検査所見のみで複合体V異常を想定することは困難であった。BN-PAGEでは複合体Vについて3種類のsub complexを検出し、各sub complexの分子量は過去に報告されているアセンブリ中間体（F1、F1＋Inhibitory factor1（IF1）、F1＋IF1＋c-ring）に合致した。検出率は培養細胞よりも凍結筋ミトコンドリアを用いた場合に高く、病原性が確立している変異を有する症例に限れば、ほぼ全例でsub complexの異常を検出した。一方で、病原性が否定的なバリアントを有する症例ではsub complexは検出されず、BN-PAGEは病原性を判断する上で有用な手法と考えた。今回新規に検出したバリアント（m.9173T>C）やこれまでBN-PAGEでの異常が報告されていない変異を有する例についても、同様のsub complexを検出し、病原性を支持する所見であった。またMT-ATP6やMT-ATP8変異では変異の部位によらず共通の病態としてアセンブリ異常が存在することも示唆された。今回の症例におけるMT-ATP6の変異の多くは、立体構造上ではMT-ATP6がコードするサブユニットaが、内膜部分を構成するサブユニットcと接する領域に集中しており、同部位でのサブユニット間の相互作用に影響すると考えた。同部位は複合体V内でプロトンが移動する経路の近傍であるため、変異により構造だけでなく機能も直接的に障害される可能性も考えられた。またmtDNA上でMT-ATP6とMT-ATP8が重なって存在するMTATP6/8オーバーラップ領域の変異ではholo complexの減少やsub complexの所見が著明であり、また凍結筋だけでなく培養細胞でもsub complexを検出した。ここから同領域の変異ではMT-ATP6の変異よりも複合体Vの構造に与える影響が大きいと考えた。評価対象試料による違いとしては、筋芽細胞・皮膚線維芽細胞よりも凍結筋を用いた場合にsub complexの検出率が高かったが、m.8993T>G/C変異例の解析では各試料でのmtDNA変異率はBN-PAGEの結果と明らかな相関はなく、変異率以外の要因を疑った。分裂を繰り返す培養細胞ではタンパクの代謝が速く、異常なアセンブリ中間体が分解されやすいのに対して、分裂しない骨格筋ではこれらが蓄積しやすいなどの原因を考えた。この結果から、BN-PAGEで解析を行う対象は培養細胞では不十分で、凍結筋での解析が望ましいと考えた。

一方、ATP加水分解酵素活性では筋芽細胞・骨格筋のいずれにおいても有意な活性低下を示した症例がなく、BN-PAGEで明らかな構造異常を認めた例でも異常を検出できなかった。この原因として、複合体VでのATP合成は完全型複合体Vの状態でのみ可能となるのに対して、ATP加水分解はsubcomplexの状態であっても可能となってしまうためと考えた。以上より、今回のATP加水分解活性の測定方法では複合体V欠損症を検出することは困難であり、方法の再検討が必要と考えた。

【結論】
MT-ATP6およびMT-ATP8変異による呼吸鎖複合体V欠損症では、BN-PAGEにより複合体Vの構造異常（sub complex）を検出した。特に、培養細胞よりも凍結筋を用いた場合に検出率が高く、病原性が確立した変異を有する症例ではほぼ全例でsub complexを検出し、BN-PAGEは変異・バリアントの病原性の評価として有用な手法と考えた。一方、ATP加水分解酵素活性の測定では、異常を検出することは困難であった。逆反応の測定ではATP合成の障害が反映されない可能性があり、少なくとも今回の測定方法ではATP加水分解活性測定は複合体Vの機能解析としては不適当と考えた。ミトコンドリア病の診断においては、解析対象の臓器をよく検討した上で、複数の評価方法を総合して判断することが重要である。