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HERファミリータンパク質を基軸とする二重標的化がん治療法の開発に向けた基礎研究

山﨑, 晶貴 東北大学

2023.03.24

概要

博士論文

HER ファミリータンパク質を基軸とする
二重標的化がん治療法の開発に向けた基礎研究

令和 4 年度
東北大学大学院薬学研究科
生命薬科学専攻
山﨑

晶貴

目次
略語一覧
第 1 章 序論
第 2 章 HER3/MET を同時標的とした大腸がんの新規併用療法の開発研究
第 1 節 背景
第 2 節 大腸がん細胞表面において HER3 と MET の発現は相関する
第 3 節 NRG1 と HGF の併用刺激は単独刺激と比較して細胞増殖を亢進させる
第 4 節 NRG1 の長時間刺激は MET のリン酸化を誘導する
第 5 節 HER3 と MET はヘテロダイマーを形成しない
第 6 節 NRG1 刺激は HGF の発現を誘導しない
第 7 節 NRG1 刺激は FOXM1 を介して MET のリン酸化を誘導する
第 8 節 NRG1 刺激は FOXM1 を介さないシグナル経路が存在する
第 9 節 Patritumab と PHA665752 の併用投与は腫瘍増殖を抑制する
第 10 節 考察
第3章

HER2/CD98 を同時標的とするバイスペシフィック抗体(HER2/CD98 BsAb)の作

製研究

第1節
第2節
第3節
第4節
第5節
第6節

背景
HER2 と CD98 は複合体を形成する
CD98 は HER2 シグナルを制御する
HER2/CD98 BsAb は HER2 シグナルを阻害し、細胞増殖を抑制する
HER2/CD98 BsAb は Pertuzumab, Trastuzumab と異なる作用機序を有する
考察

第 4 章 総括
第 5 章 実験材料および方法
第 6 章 引用文献
発表論文
謝辞

1

略語一覧
HER: Huma n e pide rmal growth fa ctor rece ptor
RT K: Receptor t yrosi ne kina se
EGF: E pide rmal growth fac tor
TGFα: Transformi ng growth fa ctor alpha
ARE G: Am phi regulin
EREG: E pire guli n
BTC: Betac elluli n
HB-E GF: Hepa rin bi ndi ng -Epi dermal growth fac tor
mAb: Monocl onal ant ibody
NRG1: Neuregulin1
HGF: Hepat ocyte growt h factor
FDA: U. S. Food a nd Drug Admi ni stra tion
ADC: Antibody-drug c onj ugat e
CAR: Chim eric anti gen rece pt or
ADCC: Anti body- dependent cellul ar cytot oxici ty
CDC: Com pleme nt - depe nde nt c ytotoxicit y
ADCP: Ant ibody -de pendent cell ul ar phagocyt osi s
GFP: Gree n fluore sce nt protein
ATP: Adenosi ne tri phosphate
FCM: Flow c ytometry
WB: We ste rn bl ot
WCL: W hole cell lysate
KO: Knockout
2

TKI: Tyrosine kina se i nhibit or
BsAb: Bispeci fic a nti body
TCR: T cell re c ept or
KD: Knockdown
sc Fv: Single-c hain va riable fragm ent
TAA: Tumor a ssoc iated ant ige n
EpCAM: E pithe lial c ell a dhe si on molecul e
CB2 R: Cannabinoid type 2 re cept or
SA: St repta vidi n beads
BBB: Blood- brai n barrier
CDR: Compl ementa rit y determi ning re gion
FR: Frame work re gion
TfR: Transferrin rece ptor
FBS: Fetal bovine serum
DMEM: Dul becc o’s modified Eagl e’s medi um
LAT1: L -type amino aci d t ransport er 1
CAT1: Cat ionic ami no acid transporte r 1
ASCT 2: Alani ne- se rine -cystei ne transporter 2
xCT: Cyst ine/ gluta mate t ransporte r
ATCC : American Type Ce ll Collec tion
pAb: Polycl onal ant ibody
BSA: B ovi ne serum albumin
PBS: Phosphate -buffere d sali ne
OE- PCR : Ove rlap ext ension - PCR
3

第 1章

序論

がんは世界中のほとんどの国で早期死亡原因の 1 位または 2 位を占めてお
り数十年単位の予測からも罹患数、死亡数ともに増えることが推測されてい
る た め 、 新 た な が ん 治 療 法 の 開 発 が 望 ま れ て い る ( Soe rjomatara m, I., & Bra y,
F., 2021; Sung, H., et a l., 2021)。 が ん の 特 徴 と し て 、 ① 増 殖 シ グ ナ ル の 恒 常 的
な 活 性 化 、② が ん 抑 制 因 子 か ら の 回 避 、③ 細 胞 死 へ の 抵 抗 、④ 永 続 的 な 複 製 、
⑤ 血 管 新 生 の 誘 導 、⑥ 浸 潤 と 転 移 の 活 性 化 、⑦ 細 胞 代 謝 の リ プ ロ グ ラ ミ ン グ 、
⑧ 免 疫 か ら の 回 避 と い っ た 8 つ に 分 類 さ れ 、そ れ ら 複 合 的 な 特 徴 は 腫 瘍 の 不
均 一 性 を 生 み 出 し 、 が ん 治 療 を 困 難 な も の と し て い る ( Ha naha n, D., 2022)。
現在のがん治療法は手術療法、放射線療法、薬物療法、免疫療法の 4 大療
法 で あ る 。 中 で も 薬 物 療 法 は 1949 年 に Mechl oret hami ne ( Nitrogen musta rd )
が 抗 が ん 剤 と し て 初 め て FDA か ら 承 認 を 受 け( Lehma nn , F., & Wennerberg, J.,
2021)、し ば ら く は 細 胞 傷 害 性 抗 が ん 剤 に よ る 治 療 が 主 流 と な っ て い た 。し か
し 、 1997 年 に 承 認 さ れ た 最 初 の 治 療 用 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 ( m Ab) で あ る B
細 胞 リ ン パ 腫 治 療 薬 Rituximab や そ の 翌 年 に 承 認 さ れ た HER2 陽 性 乳 が ん 治
療 薬 Tra stuz umab の 上 市 を 皮 切 り に mAb を 用 い た 治 療 法 は 、従 来 の 医 薬 品 で
は望めなかった極めて高い標的特異性を有し、重篤な副作用の軽減を可能に
し た ( Zhu, Z., & Ya n, L. , 2011)。 そ の 特 異 性 の 高 さ は 、 m Ab 製 剤 と し て の 利
用 に 留 ま ら ず Ant ibody -modified liposomes ( Immuno -liposome s )、ADC、CART 細 胞 療 法 と い っ た 近 年 の 新 た な モ ダ リ テ ィ へ の 応 用 に 繋 が っ て い る( Choe,
W., et al., 2016; Ke gye s, D., 2022 )。
がんに対する抗体医薬品の主な作用メカニズムは、大きく 2 つに分類でき
る 。 ま ず 抗 体 の Fc 領 域 を 認 識 す る こ と に よ っ て 誘 導 さ れ る 免 疫 作 用 が 挙 げ
4

ら れ る 。こ れ に は ADCC: 抗 体 依 存 性 細 胞 障 害 活 性 、CDC: 補 体 依 存 性 細 胞 障
害 活 性 、 ADCP: 抗 体 依 存 性 細 胞 貪 食 活 性 が 含 ま れ る ( Kang, T. H., & Jung, S.
T. , 2019)。 近 年 、 ADCC 機 能 を 高 め る た め に 、 フ コ ー ス 修 飾 の 除 去 が 効 果 的
だ と 報 告 さ れ て お り 、多 く の 抗 体 医 薬 品 に 採 用 さ れ て い る( Oka zaki, A., et al.,
2004)。次 に が ん 細 胞 に 対 す る 抗 体 の 直 接 作 用 が 挙 げ ら れ る 。こ の 直 接 作 用 は 、
通 常 の IgG 抗 体 は 分 子 量 が 約 1 50 kDa と 巨 大 分 子 で あ る た め に 、 が ん 細 胞 に
発現した受容体に対するリガンドの結合阻害または受容体同士のダイマー
形 成 を 阻 害 す る 。( Attwood, M. M., et al ., 2020 )。 こ れ ら の 働 き は 、 上 皮 が ん
に 対 す る 抗 体 医 薬 品 の タ ー ゲ ッ ト と し て 半 数 以 上 を 占 め て い る HE R フ ァ ミ
リ ー タ ン パ ク 質 を 標 的 と す る 際 に 大 き く 貢 献 し て い る( Lu, R. M., et al., 2020)。
HER フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 は 、 EGFR( HER1)、HER2 、 HER3、HER4 か ら
成 り 、 レ セ プ タ ー チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ ( RT K) と し て 増 殖 シ グ ナ ル の 起 点 に な
る こ と か ら 、 主 要 な 治 療 標 的 と さ れ て い る 。 HE R フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 は 、
HER2 を 除 い て リ ガ ン ド が 存 在 し て お り 、E GFR リ ガ ン ド( E GF、TGFα、ARE G、
EREG、BT C 、HB-E GF)、HER3 リ ガ ン ド( NRG1 、NRG2 )、HER4 リ ガ ン ド( NRG1
~ 4 、 BT C 、 HB-E GF) と い っ た リ ガ ン ド の 結 合 に よ っ て ホ モ ダ イ マ ー や ヘ テ
ロ ダ イ マ ー を 形 成 す る ( Pool, M., et al ., 2017)。 そ れ に 加 え て HE R2 が 過 剰 発
現 し 、 細 胞 表 面 で の 受 容 体 密 度 の 増 加 に よ っ て HE R2 ホ モ ダ イ マ ー ま た は
HER2/ HER3 ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 す る ( Ma adi , H., et al., 2018)。 ダ イ マ ー 形
成によりキナーゼの活性化が誘導され、自己リン酸化を介して細胞内の
MAPK 経 路 や PI3K/ AKT 経 路 に シ グ ナ ル を 伝 達 す る ( Toss, A., & Cri st ofa nilli ,
M. , 2015)( Fi gure 1A)。
特 に E GFR、HE R2 に 関 す る 基 礎 お よ び 臨 床 研 究 は 抗 E GFR 抗 体 Cetuximab 、
Pani tum umab 、 抗 HE R2 抗 体 Tra stuz uma b、 Pe rtuz umab 等 の 抗 体 医 薬 品 の 上 市
5

により治療標的としての有用性と同時に、その多くが薬剤耐性を獲得すると
い っ た 課 題 も 明 ら か に な っ て き た ( de Mel o Gagl iato, D., et al ., 2016; Mi sale,
S., et al ., 2014 )。 そ こ で 現 在 で は 、 複 数 の 分 子 を 標 的 と す る 併 用 治 療 法 や バ
イ ス ペ シ フ ィ ッ ク 抗 体( BsAb )の 開 発 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る が 、 同 時 標
的 と す る 分 子 の 選 定 が 依 然 と し て 重 要 な 課 題 と な っ て い る 。こ れ ま で 、E GFR
と HER2 の 併 用 治 療 ( Re xer, B. N., et al., 2013)、E GFR と HE R3 ま た は EGFR
と Notch の BsAb 開 発 研 究 に よ っ て( Juric , D., et al., 2015; Fu, W., e t al., 2019)、
同 時 標 的 に 有 効 な タ ン パ ク 質 候 補 が 報 告 さ れ た 。2021 年 に は 、EGFR と ME T
を 同 時 に 標 的 と し た Amiva ntama b が 承 認 さ れ た ( Xie , Y., et al., 2022)。 こ れ
ら の 開 発 戦 略 は 、HE R フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 同 士 ま た は 異 な る タ ン パ ク 質 フ
ァミリーとの相互作用に基づくものであり、その相互作用を明らかにするこ
とは治療または創薬戦略に繋がると考えられる。
そ こ で 本 論 文 で は 、益 子 ら が こ れ ま で 開 発 し て き た( Ma suko T., 2021 )、が
ん に 高 発 現 し て い る 膜 タ ン パ ク 質 を 認 識 す る m Ab を 活 用 す る こ と で( Figure
1B)、 HER フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 す る 膜 タ ン パ ク 質 を 新 た に 同 定
し、二重標的化がん治療法の開発に向けた研究 報告を以下に記す。

6

7

Figure 1

当研究グループがこれまで標的としてきた膜タンパク質

( A)HE R フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 は 、E GFR( HER1)、HER2、HE R3、HE R4 か
ら 成 る 。 HER2 は リ ガ ン ド が 見 つ か っ て い な い オ ー フ ァ ン レ セ プ タ ー と し て
リ ガ ン ド 非 依 存 的 に ホ モ ダ イ マ ー ま た は ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 す る 。 E GFR、
HER3、HE R4 は リ ガ ン ド 依 存 的 に ホ モ ダ イ マ ー ま た は ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成
し 、PI3K/ AKT シ グ ナ ル 、MAPK シ グ ナ ル を 活 性 化 さ せ 、腫 瘍 の 生 存 や 増 殖 に
寄 与 す る 。( Pool, M., et al., 2017 を 参 考 に 作 成 )
( B)合 成 ペ プ チ ド 、精 製 タ ン パ ク 質 を 免 疫 原 と し た 抗 体 作 製 法 で は 、抗 体 が
ネ イ テ ィ ブ な 抗 原 に 反 応 し な い 可 能 性 が あ る 。益 子 ら は 、GFP 融 合 - 標 的 タ ン
パクを発現させた細胞を抗体多様性に優れたラットに免疫する独自の抗体
作製法を構築した。これまで免疫原となりうる領域が小さく、作製が困難と
されてきた複数回膜貫通型タンパク質等のターゲットに対する抗体作製を
成功させてきた。

8

第 2 章 HER3/MET を 同 時 標 的 と し た 大 腸 が ん の 新 規 併 用 療 法 の 開
発研究

第 1 節 背景
が ん の 病 態 は 、腫 瘍 形 成 か ら 転 移 に 至 る ま で 、 RT K の 過 剰 発 現 や シ グ ナ ル
伝達経路間のクロストークといったシグナル伝達の乱れが引き起こすと考
え ら れ て い る ( Se ver, R., & Brugge, J. S. , 2015)。 近 年 、 代 替 増 殖 シ グ ナ ル 経
路の活性化は、受容体標的治療において薬剤耐性メカニズムの一つとして考
え ら れ て い る 。 例 え ば 、 E GFR や HE R2 を 標 的 と し た 治 療 薬 の 薬 剤 耐 性 メ カ
ニ ズ ム と し て HER3 の ア ッ プ レ ギ ュ レ ー シ ョ ン が 報 告 さ れ て い る( Gandul loSánc hez, L ., et a l., 2022 )。 H ER3 は キ ナ ー ゼ ド メ イ ン で ATP と 結 合 す る に も
関 わ ら ず 、 キ ナ ー ゼ 活 性 は 微 弱 で あ る 。 し か し 、 N RG 1 を は じ め と す る リ ガ
ン ド と 結 合 す る こ と に よ り 、 他 の H ER フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 と ヘ テ ロ ダ イ
マ ー を 形 成 す る ( Ogier, C., et a l ., 2018 )。 特 に HER2 と の ヘ テ ロ ダ イ マ ー は
強 力 な シ グ ナ ル を 伝 達 す る こ と が 知 ら れ て い る ( Trenker, R., e t al., 2021)。
HER3 キ ナ ー ゼ ド メ イ ン へ の ATP の 結 合 が HER3 に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ
し て い る か は 、 完 全 に は 明 ら か に な っ て い な い 。 し か し 、 H ER3 は 治 療 標 的
と し て 注 目 さ れ て お り 、 N RG 1 結 合 を 抗 体 で 阻 害 す る こ と は 効 果 的 に N RG 1
依 存 的 な H ER3 シ グ ナ ル を 抑 制 で き る ( Me nde ll, J., et a l., 2015:

Okit a, K.,

et al., 2020)。 さ ら に ATP 結 合 ポ ケ ッ ト を 空 間 的 に 阻 害 す る こ と は H ER3 の
活 性 化 機 能 を 阻 害 す る ( Ca mpbe ll, M. R., et a l., 2022)。
他 の 耐 性 メ カ ニ ズ ム と し て MET、IG F1R 等 の 異 な る RTK の ア ッ プ レ ギ ュ
レ ー シ ョ ン に よ る 代 替 増 殖 シ グ ナ ル の 活 性 化 が あ る ( E ngelma n, J. A., et al .,
2007; Guix, M., et al., 2008)。 特 に MET は 、 肝 細 胞 増 殖 因 子 ( HGF ) の 結 合
9

により、ホモダイマー化と自己リン酸化を誘導し、がんの増殖、浸潤、遊走
を 促 進 さ せ る 重 要 な 治 療 標 的 分 子 と し て 知 ら れ て お り( Sha o, Z., et al ., 2020 )、
Tepotini b や Cr izotini b と い っ た 分 子 標 的 薬 は 米 国 、 欧 州 連 合 お よ び 日 本 を
は じ め と す る 国 々 で 承 認 さ れ て い る ( Fu, J., et al., 2021)。
こ れ ま で 肺 が ん で は H ER3 と M ET が 複 合 体 を 形 成 す る 直 接 的 な 相 互 作 用
が 報 告 さ れ て い る が ( Taniz aki , J., et al., 2011 )、 シ グ ナ ル 伝 達 に お け る 間 接 的
な相互作用に関しては、そのほとんどが不明である。受容体レベルだけでは
なくメディエーターまたはエフェクターレベルでの間接的な相互作用が明
らかとなることで、細胞内での複雑なシグナル経路の一端を解明できる可能
性がある。
本章においては、まず大腸がん細胞株に発現する膜タンパク質の解析を行
っ た 結 果 、H ER3 と M ET の 発 現 に 正 の 相 関 関 係 が 認 め ら れ た た め 、HER3 と
MET の シ グ ナ ル 伝 達 に お い て の 間 接 的 な 相 互 作 用 を 明 ら か に し 、 同 時 標 的
化が有効であるかを検討した。

10

第 2 節 大 腸 が ん 細 胞 表 面 に お い て HER3 と MET の 発 現 は 相 関 す る
同 時 標 的 候 補 の タ ン パ ク 質 を 選 定 す る た め に 24 種 類 の ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞
株 に 発 現 す る 14 種 類 の 膜 タ ン パ ク 質 の 発 現 に つ い て FCM 法 を 用 い て 解 析
し、ヒートマップの作成とクラスター分類を行った。細胞株のクラスター分
類 に お い て は 、SNU- C1/ CCD841 と そ の 他 の 大 腸 が ん 細 胞 株 に 分 類 さ れ た 。膜
タンパク質のクラスター分類においては 3 つのクラスターに分類された。一
つ目のグループは主にがん遺伝子産物、二つ目のグループはアミノ酸トラン
スポーター、三つ目のグループは、接着因子に分類され 、発現解析からタン
パ ク 質 フ ァ ミ リ ー に 分 か れ る こ と を 確 認 し た ( Fi gure 2A)。 HE R フ ァ ミ リ ー
タ ン パ ク 質 の 発 現 に 着 目 す る と 、 こ れ ま で 大 腸 が ん 組 織 に お い て HER2 と
HER3 の 発 現 は 正 の 相 関 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る が( Conra di, L . C., et al.,
2019)、本 検 討 に お い て も HE R2 と HER3 の 発 現 に 正 の 相 関 関 係 が 認 め ら れ た
( Figure 2B)。 ま た 新 た に HER3 と MET の 発 現 に 正 の 相 関 関 係 が あ る こ と を
見 出 し た ( Fi gure 2C )。 HER3 と MET の 発 現 に つ い て は 免 疫 組 織 染 色 に よ っ
て正常なヒト大腸組織と比較してヒト大腸がん組織で高発現していること
を 確 か め た ( Figure 2D)。 こ こ か ら HER3 と MET が 大 腸 が ん 細 胞 増 殖 に 与
え る 影 響 を HE R3 と MET が 高 発 現 す る 大 腸 が ん 細 胞 株 SW1116 細 胞 で 検 討
した結果を記す。 ...

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参考文献

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