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骨格形成におけるADAMTS17の機能解析

尾市, 健 東京大学 DOI:10.15083/0002002469

2021.10.15

概要

軟骨細胞の分化は軟骨内骨化に必須の行程である。最初に間葉系前駆細胞が凝集し、軟骨に分化し、2型コラーゲンやアグリカンなどの軟骨特異的な基質蛋白を産生する。軟骨細胞の増殖と基質産生に伴い軟骨は増大する。次いで軟骨細胞は増殖をやめ10型コラーゲン(Col10a1)の分泌に特徴づけられる肥大軟骨細胞に分化する。最終的に、肥大軟骨細胞はアポトーシスを起こし、軟骨基質はmatrix metalloprotease 13(Mmp13)を含むタンパク分解酵素により分解され骨に置換される。

　この軟骨内骨化の過程の中で、Fibrillin蛋白はマイクロフィブリルと呼ばれる微小繊維の中心構造を成し、骨成長の制御に携わる事が知られている。マイクロフィブリルはあらゆる臓器の細胞外基質に存在し、組織の物理的特性を決定し、また力学ストレスを伝達する役割を担い、軟骨成長板の細胞外基質にも存在することが知られている。また、マイクロフィブリルはbone morphogenetic protein(BMP)やtransforming growth factor beta(TGF-β)の局所でのバイオアベイラビリティーを調節することでBMPおよびTGF-βシグナルを制御している。

　近年、マイクロフィブリルの機能や構造がA Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin motifs(ADAMTS)蛋白により制御される事が報告されている。ADAMTS蛋白は19個の分泌されるADAMTSプロテアーゼと7個のADAMTS-Like(ADAMTSL)蛋白からなるスーパーファミリーである。ADAMTSプロテアーゼは相同性の高いN末端側のメタロプロテイナーゼドメインとディスインテグリン様ドメイン、および細胞外基質と結合するとされるC末端側のトランスポゾン様リピートを有する。ADAMTSL蛋白はN末端側のプロテアーゼドメインを欠くが、C末端側はADAMTSプロテアーゼと相同性の高いドメインを有す。近年ADAMTS10やADAMTSL2はマイクロフィブリルでのFBN2の組成を増大させることや、ADAMTS10, ADAMTSL4, ADAMTSL6はin vitroもしくはin vivoでマイクロフィブリルの形成を増大させるといったマイクロフィブリルとADAMTS/L蛋白の種々の相互作用が報告されている。

　ADAMTS17遺伝子は常染色体劣性遺伝のWeill-Marchesani-like症候群の原因遺伝子である。Weill-Marchesani-like症候群は稀な結合組織疾患で、低身長および眼症状を呈する。一方でWeill-Marchesani症候群はFBN1遺伝子の優性突然変異、もしくはADAMTS10遺伝子の劣性突然変異によって起こる。Weill-Marchesani症候群では、低身長および眼症状に加え、短指症、皮膚肥厚に伴う関節拘縮、および弁膜症を呈することで両症候群は区別される。また、ADAMTS17遺伝子はヒトの身長を規定する因子としても報告されており、ADAMTS17遺伝子は骨格形成に関与すると考えられるが、どのように骨格形成を制御しているかは未だ分かっていない。本研究では、ADAMTS17の骨格形成における機能を解析するため、Adamts17 floxマウスを作製し、CAG-Creマウスと掛け合わせることでコンベンショナルなノックアウト(KO)マウスを作製しその表現系を解析した。Laser microdissectionおよびRNA-seqを用いた発現解析により、Adamts17のKOにより変化するシグナルのスクリーニングを行い、免疫組織染色にてその妥当性を評価した。In vivoにおける解析結果をin vitro, ex vivoの系においても検証した。

　まずAdamts17KOマウスの表現系の解析を行った。Adamts17KOマウスは生直後には明かな骨格形成異常は見られなかったが、生後より成長障害、長管骨の短縮が見られた。また、Weill-Marchesani症候群に特徴的な症状である短指症および皮膚の肥厚を認めた事から、Adamts17KOマウスはWeill-Marchesani症候群を模倣しているものと考えられた。軟骨特異的にAdamts17をノックアウトしたCol2a1-Cre; Adamts17fl/flマウスも、成長障害、長管骨の短縮を認めたことからAdamts17KOマウスの骨格形成障害は軟骨内骨化の異常に起因すると考えられた。Adamts17KOマウスの軟骨成長板を組織学的に評価したところ、WTと比べ肥大軟骨層の短縮が見られ、またFibrillin-2蛋白の発現が増強していた。

　次いでAdamts17KOマウスにおける成長障害の分子メカニズムを探るべく、Adamts17KOマウスおよびWTマウスの成長板軟骨からlaser microdissectionによりmRNAを抽出し、精製増幅した後RNA-seqによる網羅的解析を行った。Gene Ontology解析を行い、上位5つに入るBiological Processを調べたところ、positive BMP signalingが最も有意なBiological Processであった。この結果の妥当性を調べるため、BMPシグナルの下流蛋白であるpSmad1の発現を免疫染色で調べたところ、Adamts17KOマウスの成長板軟骨で有意にpSmad1の発現が減少していた。初代肋軟骨培養細胞を用いてpSmad1の細胞免疫染色およびwestern blottingを行った所、in vitroでもAdamts17KOマウスではBMPシグナルが減弱していた。同じ培養系でBMP2, 4, 7の発現量をqRT-PCRで調べたところ両遺伝子型では明かな差が見られず、BMPリガンドの転写調節によらないBMPシグナルの低下が示唆された。

　次にAdamts17KOが軟骨分化に与える影響をmonolayerおよびorgan cultureの系で調べた。Monolayerの系として、既報にならい初代肋軟骨細胞に肥大分化を誘導した。Adamts17KOマウス由来の肋軟骨細胞はWTと比べ有意にアリザリンレッド染色での染色領域が小さく、terminal differentiation markerであるCola10a1およびMmp13の発現量が有意に減少していた。また、このKOマウスで見られたterminal differentiationの遅延はrhBMP投与によりキャンセルされた。このことからAdamts17KOマウスではBMPシグナルの減少によりterminal differentiationが遅延していると考えられた。次に胎生15日齢のマウス中足骨を用いた器官培養を行った。中足骨の器官培養は、取り出した中足骨をAscorbic Acidおよびβ-glycerophosphateを含有するmediumで培養することで軟骨細胞の肥大化、石灰化までの軟骨内骨化の過程を模倣できる生理的な系である。Adamts17+/-とAdamts17-/-を掛け合わせて産まれた同腹仔の中足骨を用いた。Adamts17+/-の中足骨は5日目には石灰化が明視野で見られたが、Adamts17-/-の中足骨では多くの例で見られなかった。Adamts17-/-中足骨での石灰化遅延にBMPシグナルが関与しているか調べるためにday5でpSmad1の免疫染色を行ったところAdamts17-/-中足骨で有意にpSmad1陽性細胞率が低かった。実際、day1からrhBMPを投与する事で、Adamts17-/-中足骨の石灰化遅延はキャンセルされた。以上の実験からAdamts17KOの軟骨細胞ではBMPシグナルの減弱によりterminal differentiationが抑制されていると考えられた。

　本研究では我々はAdamts17KOマウスを作製し、その表現型を解析した。Adamts17KOマウスは生後発育障害、長管骨長、短指症、および皮膚肥厚をきたし、Weill-Marchesani症候群をphenocopyしていた。またAdamts17KOマウスの成長板軟骨では肥大層が短縮し、Fbn2蛋白の増生が見られた。Laser microdissectionおよびRNA-seqを用いた網羅的発現解析によりAdamts17KOマウスでのBMPシグナルの変化が示唆され、実際にAdamts17KOマウスではin vivoおよびin vitroでBMPシグナルの減弱が見られた。また、Adamts17KOマウス由来の軟骨細胞で見られたterminal differentiationの遅延はrhBMP投与によりキャンセルされた。これらのことからAdamts17はBMPシグナルを介して骨格形成に関与していると示唆された。

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