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凍結保存によるウシ受精胚のミトコンドリア機能低下と品質管理機構を介した回復

林 武司 東京農業大学

2020.05.12

概要

受精胚の凍結保存は、胚の利便性を大きく高め、効率の良い移植を可能にするが、凍結による受精胚の損傷は、融解後の品質や受胎率の低下を招いている。凍結による損傷は細胞内 DNA やミトコンドリアへ及んでいることが報告されている。受精胚のエネルギー生産のうち多くを賄うミトコンドリアの損傷は凍結融解後の受精胚の回復や生存性を低下させる可能性が考えられる。本研究では、1)ウシ胚のミトコンドリア機能、DNA の完全性、および発達能力に対する緩慢凍結保存の影響を評価し、凍結融解後培地へのレスベラトロール添加が凍結融解胚盤胞の生存性を改善するかどうかを調べた。2) さらに凍結保存前のレスベラトロール処理が凍結融解後の受精胚に及ぼす影響を調べるとともに、移植後の受胎率について調査した。1) 受精胚に対して凍結保存が及ぼす影響を調べるために、短鎖および長鎖ミトコンドリアシーケンスをターゲットとするリアルタイム PCR によって測定したミトコンドリア DNA 完全性( mtDNA) や、ATP 含有量を測定したところ、新鮮胚と比較して、凍結融解後 24 時間培養した受精胚では有意に減少した。加えて二本鎖 DNA に対する免疫染色により、凍結融解胚の DNA損傷が明らかになった。凍結融解胚を 0.5µM レスベラトロールを含む培地で培養すると、胚の SIRT1 発現と生存率は、溶媒処理胚( 対照区)と比較して著しく改善した。 さらに、融解後の培養中培地に含まれた mtDNA 含有量は、溶媒処理胚よりもレスベラトロール処理胚の方が高かった。これらの結果から融解後培養液添加へのレスベラトロールが受精胚の生存性向上に働くことが示唆されたが、ウシ、ヒト等の受精胚移植は凍結融解後から速やかに移植することが一般的であり、

融解後の長時間培養は現場での利用に即さない。よって現場での利用を考慮し、凍結保存前にレスベラトロール処理を行い融解後は速やかに移植することを想定して以下の試験を行った。2) ウシ受精胚における凍結保存前のレスベラトロール処理による SIRT1 発現増加が、凍結損傷からの回復を助け、受精胚の品質を改善するという仮説のもとに試験を実施した。供試胚は受精後 6 日目または 7 日目の体外受精胚を用い、レスベラトロール 1µM とともに 6 時間また は 24 時間培養した。レスベラトロール処理( 6 時間または 24 時間)は、胚盤胞発生率や胚盤胞のグレードには影響しなかったが、処理胚では SIRT1 の発現レベルが大幅に増加した。レスベラトロールで前処理した受精胚を凍結融解した後、48 時間培養後の透明帯脱出率は、レスベラトロール処理した受精胚の方が有意に高かった。さらに、レスベラトロールの前処理により、処理時間に関係なく、受精胚のミトコンドリア DNA のコピー数が大幅に増加した。移植試験では 6 日齢の体外受精胚と、6.5 日齢の体内受精胚を用い、体外受精胚は 24 時間、体内受精胚は 6 時間レスベラトロールで凍結前処理を行った。レスベラトロール前処理( 6 または 24 時間) は、体内および体外生産胚の両方で、対照区に比べ受胚牛への移植後の受胎率が高かった。結論として、ウシ受精胚の緩慢凍結は、胚盤胞のミトコンドリアの完全性と機能を低下させる。一方で融解後の培養中にレスベラトロールで処理することで SIRT1 発現が向上し、受精胚内ミトコンドリアが低下し、胚の生存率が向上する。さらにウシ受精胚をレスベラトロールで凍結前処理すると、ミトコンドリア合成により凍結解凍後の受精胚の品質が改善されることが明らかになった。

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