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再生組織保存法の開発を目的とした新規生体外器官培養システムの検討

湯田, 智美 YUTA, Tomomi ユタ, トモミ 九州大学

2023.09.25

概要

九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository

Development of a novel ex vivo organ culture
system to improve preservation methods of
regenerative tissues
湯田, 智美

https://hdl.handle.net/2324/7157311
出版情報：Kyushu University, 2023, 博士（歯学）, 課程博士
バージョン：
権利関係：Creative Commons Attribution 4.0 International

（様式３）

氏

名

：湯田 智美

論 文 名

：Development of a novel ex vivo organ culture system to improve
preservation methods of regenerative tissues
(再生組織保存法の開発を目的とした新規生体外器官培養システムの
検討)

区

：甲

分

論

文

内

容

の

要

旨

近年、再生技術の進歩により、多能性幹細胞や組織工学技術を用いて、肝臓や心臓およ
び 毛 な ど 様 々 な 器 官 の 再 生 が 現 実 の も の と な り つ つ あ る 。し か し な が ら 、再 生 臓 器 が 移 植
に 適 し た 大 き さ お よ び 発 生 段 階 に 達 す る ま で に は 長 い 時 間 を 要 す る 。患 者 に 再 生 臓 器 を 安
定 的 に 供 給 す る た め に は 、再 生 臓 器 を 移 植 に 適 し た 状 態 で 保 存 す る 技 術 の 開 発 が 必 要 で あ
る 。組 織 保 存 期 間 を 延 長 す る 方 法 と し て 、移 植 前 ド ナ ー 臓 器 の 低 温 保 存 や 細 胞 凍 結 保 存 な
ど が 行 わ れ て お り 、温 度 管 理 は 保 存 期 間 に 影 響 を 与 え る 大 き な 要 因 の 一 つ で あ る こ と が わ
か っ て い る 。現 在 の と こ ろ 、生 殖 細 胞 や 血 液 、歯 髄 幹 細 胞 な ど の 細 胞 の 長 期 凍 結 保 存 は 臨
床 応 用 さ れ て い る が 、一 方 で 試 料 の 厚 み が あ る ド ナ ー 臓 器 や 再 生 臓 器 に 対 す る 効 率 的 な 長
期 保 存 方 法 は 未 だ 確 立 さ れ て い な い 。組 織 長 期 保 存 を 目 指 す べ く 至 適 保 存 温 度 を 検 討 す る
た め に は 、ま ず そ の ス ク リ ー ニ ン グ 方 法 を 確 立 す る 必 要 が あ る 。こ れ ま で の 研 究 で 、発 生
途 中 の 歯 胚 を 用 い た 生 体 外 器 官 培 養 法 を 確 立 し 、発 生 器 官 に さ ま ざ ま な 影 響 を 与 え る 因 子
の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ て き た 。こ の 方 法 が 培 養 温 度 な ど の 環 境 因 子 の 変 化 が 発 生 途 中 の
歯 胚 に も た ら す 変 化 を 検 討 す る の に 有 用 だ と 考 え 、本 研 究 で は マ ウ ス 歯 胚 器 官 培 養 法 を 用
い て 、組 織 の 長 期 保 存 必 要 な 温 度 条 件 を 検 討 し 、温 度 依 存 的 に 組 織 発 生 を 制 御 す る 方 法 の
確立を目的として研究を行った。
胎 生 14日 齢 (E14)マ ウ ス 歯 胚 を 用 い て 器 官 培 養 を 行 い 、 4℃ お よ び 25℃ の 低 温 条 件 で 7日
間 保 存 し た と こ ろ 、歯 胚 発 生 の 停 止 お よ び 遅 延 が 認 め ら れ た 。そ の 後 、通 常 の 培 養 温 度 で
あ る 37℃ に 変 更 し 、器 官 培 養 を 行 っ た と こ ろ 、歯 胚 の 発 生 が 再 開 し 、正 常 な 歯 胚 形 成 が 認
め ら れ た 。 こ の 現 象 は 歯 胚 の み な ら ず E13マ ウ ス 顎 下 腺 で も 同 様 に 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、
低 温 で の 保 存 期 間 を 延 長 し た と こ ろ 、 4℃ 低 温 保 存 し た 歯 胚 は 保 存 期 間 21日 を 超 え る と そ
の 後 の 37℃ で の 歯 胚 発 生 率 が 低 下 し た 。 さ ら に 、 28日 間 低 温 保 存 し た と こ ろ 、 4℃ 保 存 群
で は そ の 後 の 37℃ で の 歯 胚 発 生 が み ら れ な か っ た の に 対 し 、25℃ 保 存 群 で は 低 温 保 存 し た
歯 胚 の う ち 40％ で 37℃ で の 歯 胚 発 生 再 開 が 見 ら れ た 。ま た 、37℃ で 再 発 生 さ せ た 歯 胚 を エ
ナ メ ル 上 皮 分 化 マ ー カ ー で あ る 抗 Epiprofin (EPFN) 抗 体 で 免 疫 染 色 し た と こ ろ 、 4℃ で 21
日 以 上 低 温 保 存 し た 歯 胚 で は 歯 胚 構 造 を 認 め ず 、EPFNの 発 現 が 見 ら れ な か っ た の に 対 し 、
25℃ 保 存 群 で は 28日 間 低 温 保 存 し た 歯 胚 に お い て も 歯 胚 構 造 及 び 歯 胚 上 皮 部 分 へ の EPFN
発 現 が 見 ら れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 4℃ で の 長 期 保 存 で は 歯 胚 の 発 生 再 開 が 阻 害 さ れ 、 歯
胚 長 期 低 温 保 存 に は 25℃の 方 が 有 利 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
さ ら に 、培 養 温 度 が 歯 胚 の 形 態 形 成 に 与 え る 影 響 を 確 認 す る た め 、そ れ ぞ れ 37℃ 、33℃ 、
29℃ 、25℃ お よ び 4℃ で 10日 間 低 温 培 養 し た 歯 胚 の 形 態 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、37℃ か ら 4℃

へ 培 養 温 度 が 低 下 す る に つ れ 、 段 階 的 に 歯 胚 の 形 態 形 成 が 遅 延 し 、 4℃ 保 存 し た 歯 胚 で は
形 態 変 化 が 認 め ら れ な か っ た 。ま た 、低 温 培 養 が 歯 胚 の 分 化 に 与 え る 影 響 に つ い て 解 析 す
る た め 、 歯 胚 分 化 マ ー カ ー で あ る Epfn 、 Ame loD 、 ameloblastin お よ び dentin
sia lophosphoprote inの 発 現 を RT-qPCR解 析 で 確 認 し た と こ ろ 、分 化 マ ー カ ー の 発 現 も 培 養 温
度 が 下 が る に つ れ て 発 現 が 低 下 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 4℃ あ る い は 25℃ で 10日 間
低 温 保 存 し た 歯 胚 に お け る 幹 細 胞 マ ー カ ー se x-determining region Y-box 2お よ び 歯 の 発 生
初 期 の マ ー カ ー paired like homeodomain 2、 paired boxe d 9お よ び msh homeobox 1の 発 現 を
RT-qPCR解 析 に て 確 認 し た と こ ろ 、 4℃ 保 存 群 と 比 較 し て 25℃ 保 存 群 で は 歯 の 幹 細 胞 マ ー
カ ー や 初 期 分 化 マ ー カ ー の 発 現 が 維 持 さ れ て お り 、低 温 保 存 後 の 37℃ に お け る 歯 胚 発 生 率
に 影 響 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。ま た 、25℃ の 低 温 保 存 し た 歯 胚 の RT-qPCR解 析 で は 、
cold-inducible RNA-binding protein、 RNA- binding motif prote in 3お よ び serine and arginine
rich splic ing fac tor 5な ど の 低 温 シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン (CS P) の 発 現 の 上 昇 が み ら れ る 一 方
で 、4℃ 保 存 し た 歯 胚 で は CSPの 発 現 を 認 め な か っ た 。こ の CS Pの 発 現 の 有 無 が 幹 細 胞 性 の
維 持 に 影 響 を 与 え 、低 温 に よ る 長 期 保 存 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
ま た 、一 般 的 に 細 胞 や 臓 器 を 培 養 す る に は 、培 養 液 の pHを 安 定 さ せ る た め に 、CO 2 濃 度 5％
に 調 整 し た CO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー が 必 要 で あ る が 、 今 後 大 量 な 組 織 保 存 を CO 2 管 理 下 で 行
う と す る と 大 規 模 な 装 置 を 要 す る 。 し た が っ て 、 こ の 25℃ 組 織 低 温 長 期 保 存 に て CO 2 濃 度
管 理 が 必 要 か を 確 認 す る た め 、 CO2濃 度 5%群 と 大 気 中 と 同 じ CO2濃 度 0.03%群 に 分 け て そ
れ ぞ れ 25℃ で 28日 間 歯 胚 を 保 存 し そ の 後 37℃ で 培 養 し 歯 胚 を 発 生 さ せ た と こ ろ 、両 群 間 で
37℃ で の 歯 胚 発 生 率 及 び そ の 歯 胚 形 態 に 大 き な 差 は 認 め ら れ ず 、25℃ 低 温 保 存 で は CO 2 濃
度管理が必須ではない可能性が示唆された。
以上の結果より、発生途中の組織を従来の培養温度より低い温度で培養することで簡便
に 組 織 発 生 段 階 を 制 御 し 、組 織 長 期 保 存 を 可 能 と す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。ま た 、本 研 究
で 検 討 し た 低 温 下 で の 歯 胚 生 体 外 器 官 培 養 法 は 、組 織 保 存 至 適 保 存 温 度 を 検 討 す る た め の
簡 便 な ス ク リ ー ニ ン グ 方 法 と し て 有 用 で あ り 、ま た そ の 至 適 温 度 が 25℃ で あ る 可 能 性 が 示
さ れ た 。 こ の 25 ℃ と い う 温 度 が 長 期 組 織 保 存 に 有 用 で あ る 理 由 を 検 討 す る た め 、 今 後 は
CSPが 組 織 発 生 過 程 で も た ら す 作 用 に つ い て さ ら な る 研 究 が 必 要 で あ る 。 ま た 、本 研 究 で
は歯や唾液腺などの上皮間葉相互作用により発生する組織に限局して研究を行っており、
血管を有する他臓器などについてもこの現象が適応できるのか検討する必要がある。
本研究は、歯の器官培養をモデルとした
iPS cell stem cell
培養組織保存法における簡便なスクリー
ニ ン グ 法 を 提 供 し た 。こ の 方 法 は 簡 便 に 組

patient
harvesting

織発生の程度を直接目で確認することが

transplantation

可 能 で あ り 、 今後は組織のさらなる長期保存

differentiation
induction

を目指し培養液や薬剤を検討する際のスクリー
ニング方法としても有用であると考えられる。

Regenerative
medicine
cultivation

transport

培養温度を制御することにより組織発生段階を
調整し再生臓器の長期保存ができれば、必要に
応じてタイムリーに臓器提供を行うことが可能
となる (図 1)。本 研 究 で 得 ら れ た 知 見 は 、今

Regenerated tissues

25°C
CO2 0.03%
appropriate conditions for
long-term preservation

Control size
Control development

limitations

temperature

後 の 臓器移植技術や再生医療の進 展 に 寄 与 す
るものである。

preservation

Screening system for the preservation method

図 1

本研究で検討した組織保存条件概略図

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Acknowledgements

We are grateful to the Research Support Center, Research Center for Human Disease Modeling, Kyushu University Graduate School of Medical Sciences for their technical assistance. This study was supported by a grant-in-aid

from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (JP21K19610, JP21H03150 to K.Y. and

JP17H01606 to S.F.). This work was supported by the JST FOREST Program (JPMJFR2013 to K. Y.). K. Y. was

financially supported by the Takeda Science Foundation.

Author contributions

T.Y. and K.Y. conceptualized the experiment and wrote the manuscript. T.Y. and T.T. performed the experiments

and data analysis, with contributions from Y.C., K.M., K.F., K.M., Y.F., and J.K. T.I., I.T., S.F., and K.Y. supervised

the study. All authors reviewed the manuscript.

Competing interests The authors declare no competing interests.

Additional information

Supplementary Information The online version contains supplementary material available at https://​doi.​org/​

10.​1038/​s41598-​023-​29629-2.

Correspondence and requests for materials should be addressed to S.F. or K.Y.

Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.

Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and

institutional affiliations.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International

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© The Author(s) 2023

Scientific Reports |

Vol:.(1234567890)

(2023) 13:3354 |

https://doi.org/10.1038/s41598-023-29629-2

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Supplemental information

Development of a novel ex vivo organ culture system to improve preservation

methods of regenerative tissues

Tomomi Yuta, Tian Tian, Yuta Chiba, Kanako Miyazaki, Keita Funada, Kanji Mizuta,

Yao Fu, Jumpei Kawahara, Tsutomu Iwamoto, Ichiro Takahashi, Satoshi Fukumoto,

Keigo Yoshizaki

Supplemental Figure S1

preserve

T1

+ 1 day

+ 3 day

+ 5 day

+ 7 day

T2 (+ 10 day)

N/A

4℃

25℃

37℃

T0

recovery

Supplementary Figure 1. Photographic analysis of cultured E14.5 tooth germs in lowtemperature preservation conditions related to Fig. 1c. Scale bars, 200 µm.

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