論文の公開元へ腫瘍組織を利用したmonoclonal抗体産生による肺の浸潤性粘液性腺癌の細胞表面抗原の探索
概要
1. 肺癌の臨床学的特徴
本邦における死亡原因の第一位は、男女ともに悪性新生物であり、悪性新生物による死亡率は年々増加傾向にある。国立がん研究センター癌対策情報センターの発表では、2017年の癌死亡数の内、肺癌は男性の第1位(24%)、女性の第2位(14%)を占め、男女併せて第1位(19%)である（図1）。肺癌は主に4大組織亜型として、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌を含む神経内分泌癌、大細胞癌に分類される。肺癌の発生要因として、扁平上皮癌では喫煙やヒ素の曝露が、小細胞癌では喫煙が知られている。扁平上皮癌、小細胞癌については、禁煙や環境因子の改善によりいずれも発生率は減少傾向だが、腺癌は増加し、手術症例においても、手術症例・非手術症例全体においても、肺癌全体の約半数を占めている(1, 2)（図2）。肺腺癌の70%以上が進行期で発見され、肺腺癌の進行期における死亡率は未だに高い(3-5)(図3)。
2. 浸潤性粘液性腺癌について
肺腺癌は腺上皮への分化を呈する上皮性の悪性腫瘍で、肺胞置換性、乳頭状、腺管状、微小乳頭状、充実性の増殖を呈し、しばしば異なる増殖形態が混在する。浸潤の基準としては肺胞置換性以外の増殖形態、活動性の線維芽細胞の増生、胸膜浸潤、リンパ管・血管侵襲、壊死が挙げられる(5)。
浸潤性粘液性腺癌(invasive mucinous adenocarcinoma, IMA)はWHO第4版で新たに定義された肺腺癌の特殊型のひとつであり、肺腺癌の約5%を占める(5)。CT画像上、気管支透亮像(air bronchogram)を含む広範な浸潤影(consolidation)として認識され、肺炎様の分布を呈する症例と、通常型の肺腺癌と同様、単結節状の病変として認識される症例がある(6)。形態学的には結腸の杯細胞に類似した、高円柱状で細胞質内に豊富な粘液を含有する腫瘍細胞から成ることが特徴である(5)。免疫組織化学的にも、結腸などの消化管に発現する転写因子であるHNF4-αが陽性である一方, 肺腺癌の多くに発現する転写因子であるTTF-1は陰性であることが知られている(7)(図4)。また、分子生物学的にKRAS突然変異が高率に認められ、更に一般の肺腺癌で多く検出されるバリアント(G12C)と比較して、結腸・直腸および膵胆道系で検出されるバリアント(G12D, G12V)の占める割合が多いことが報告されている(8)。ただし、IMAの発生・進展におけるKRASの役割については未だ解明されていない(9)。
我々は最近、KRAS遺伝子変異を有し、多段階発生を示唆するIMAの一例を報告した(10)。本症例では、背景となるIMAの内部に、非粘液産生性の腫瘍細胞から成る充実部分が存在し、充実部分の腫瘍細胞は、背景の粘液産生性の腫瘍細胞と比較してより高度の細胞異型を呈していた。免疫組織化学的にはいずれの成分もTTF-1陰性、HNF4-α陽性であったが、p53は充実成分にのみ陽性であった。分子生物学的にいずれの成分も共通のKRAS遺伝子変異(p.G12V mutation)を検出されたが、TP53遺伝子の病原性変異(p.P278L mutation)は充実成分にのみ検出された。以上より、充実部の腫瘍細胞は、背景のIMAの腫瘍内での多段階的な進行を見ていると考えられた。本症例のように、IMAには非粘液産生性の肺腺癌である腸型腺癌への多段階発生を疑う症例も存在し、IMAの臨床的な実体については、まだ完全に確立されていない。
さらに、IMAの予後については、文献により報告が異なる。Yoshizawaらは、Stage Iの肺腺癌の組織型ごとの予後について、再発までの期間を検討した結果、IMAは予後不良群に分類されると報告している(11)。一方、ChaらはStage IVのIMAとその他の肺腺癌で生存期間を比較した結果、IMAは肺内転移の割合が高い一方、肺以外の臓器への遠隔転移の割合が低く、その他の肺腺癌群と比較して予後が良好であると報告している(12)。
IMAは肺内転移の傾向が強い腺癌亜型である(5)。肺内転移を呈するIMAでは、非腫瘍部の気腔内に浮遊する腫瘍細胞や粘液の存在がしばしば確認されることから、IMAの肺内転移の機序としては、腫瘍細胞の経気道散布が考えられている(13, 14)。
3. 肺腺癌の肺内転移および経気道散布について
肺腺癌の遠隔転移先として、最も頻度が高い臓器は肺である。特に、発見時から1ヶ月以内の遠隔転移先としては、肺内転移が遠隔転移全体の75%を占めるという報告がある(15)。
肺腺癌の肺内転移の機序としては、一般的な遠隔転移の径路である血行性転移、リンパ行性転移、播種以外に、腫瘍細胞の経気道散布(aerogenous spread)という機序が提唱されている(16)。‘経気道散布’とは、腫瘍細胞が肺胞中隔に沿って発育する過程で、基底膜から遊離し、肺胞腔内および気道内を浮遊し、原発巣とは異なる領域の肺内に転移巣を形成するという概念である。経気道散布には、(i)腫瘍細胞の基底膜からの遊離、(ii)遊離後の腫瘍細胞の生存と移動、(iii)転移部への腫瘍細胞の接着と増殖、という3段階を経る必要がある。経気道散布に関して、(i)および(ii)の機序について、いくつかの文献的報告が存在する。(i)について、in vitroの実験では、Wislezらが、肺腺癌の培養細胞であるA549の細胞株と好中球を相互作用させることで、A549の細胞接着能が減弱することを報告している(17)。同論文では、細胞接着因子であるI-CAMの抗体がA549の細胞接着能を減弱させることや、肺腺癌組織を用いた免疫組織化学的検討において、細胞接着が保たれた腫瘍細胞ではI-CAMが細胞膜および細胞質に発現するのに対し、細胞接着が減弱した状態ではI-CAMが細胞質内に限局することが報告されている。(ii)について、細胞外マトリクスとの接着を失った細胞は通常アポトーシスに陥り、このアポトーシスはアノイキスと称されている(18)。Kodamaらは、細胞接着が減弱した状態のA549細胞を用いたin vitroの実験で、Laminin 5の成分であるLAMC2の発現によりA549のアポトーシスが妨げられること、免疫組織化学的にLaminin 5およびLaminin 5のレセプターであるIntegrin α6の発現がA549の細胞膜に見られることを報告している(19)。Wislezらは肺癌患者のBALF中にHepatocyte Growth Factor(HGF)が検出されること、in vitroの実験でHGFにより肺癌細胞株の遊走が促進されること、免疫組織化学的に肺癌患者の好中球にHGFの発現が、癌細胞にHGFの受容体であるc-metの発現がそれぞれ確認されることを報告し、腫瘍細胞の経気道散布にHGFが関与している可能性を示唆している(20)。
4. 細胞膜タンパクについて
上皮細胞の細胞膜に発現する膜蛋白は、主に4つの機能を果たしている(21)。
(i) 連結帯の形成:細胞同士、および細胞と基底膜間の接着
(ii) イオンや代謝産物などの輸送:細胞内外の物質の交換
(iii) シグナル分子に対する受容体:細胞の活動に必要な細胞外シグナルの細胞内への伝達
(iv) 特定の反応に対する酵素:細胞内の特定の活動の触媒
たとえば細胞膜タンパクのひとつであるCadherinは上皮細胞同士の接着結合(Adhesion Junction)を担う細胞膜タンパクの一つで、細胞内ではCateninやVinculin等の連結タンパクを介してKeratinやActin filamentと、細胞外では隣接する上皮細胞のCadherinと、それぞれ接合することで、上皮細胞間の強力な接着を担っている。I-CAM1やSelectinは免疫細胞同士の接着を担う接着因子の一つである(図5)。
Intergrinは代表的な細胞膜タンパクの一つで、上皮細胞の基底膜への接着を担う。具体的には、基底膜と上皮の接合において、細胞内部ではKeratin filamentと、基底膜では細胞外マトリックスのLamininと連結し、ヘミデスモソームを形成する(図5)。
一方、すでに実地臨床や病理診断における癌診断の補助等の目的で汎用されている癌マーカーの内、免疫組織化学的に腺癌の腫瘍細胞の細胞膜に発現するタンパクとしては、癌胎児性抗原であるcarcinoembryonic antigen(CEA)や、糖脂質であるCA19-9, CA125等が挙げられる(22)。これらは糖鎖修飾を受けた糖タンパク質で、たとえばCEAは分子量が180kDaであり、1molあたり28本のN-結合型糖鎖とGlycosylphosphatidylinositol(GPI)が結合した膜結合型糖タンパク質である。これらの糖タンパク質は様々な固形癌で発現していることが知られている。Thomasらは、結腸癌の細胞株を用いたin vivoの実験で、CEAがE-selectin, L-selectinのリガンドとして働くことで細胞同士の接着をコントロールしていることを報告している(23)。また、近年ではこれらの糖タンパク質の内、癌に特異的な糖鎖部分を認識するモノクローナル抗体が同定されている(24, 25)。
このように、病理組織学的にヒトの腫瘍細胞の細胞膜において発現が確認され、腫瘍細胞の接着因子として機能することが報告されているタンパクは存在するが、前項で述べた通り、肺腺癌の肺内転移および経気道散布については、ヒトの腫瘍組織そのものを用いた研究の報告がない。
5. 研究全体の目的
IMAは非粘液性の肺腺癌に比較してしばしば同側肺の異なる肺葉や、対側肺に肺内転移を合併することが知られる一方、肺以外の臓器への遠隔転移が他の肺腺癌に比較して少ないとされる。以上より、IMAの細胞膜に発現している、細胞-基底膜接着に関連する何らかのタンパク質が、IMAの経気道散布に関与しているという仮説を立てた。
筑波大学診断病理研究室では、以前より単クローン抗体を利用し、胎児性マーカーを探索する研究を行ってきた。猪山らは、胎生7週のミニブタ胎仔肺を免疫原として、マウスに免疫し、マウス単クローン抗体を作製し、胎児性タンパクのひとつであるDrebrinを同定した(26)。Drebrinは腫瘍細胞の細胞質に発現し、肺腺癌の進行と共に発現が増加しており、Drebrinの発現が肺腺癌患者の予後マーカーとなることを証明した(26)。そこで本研究では、同様の手法を用いて、IMAの腫瘍細胞の細胞膜成分を抗原としたモノクローナル抗体を作製することで、腫瘍の経気道散布に関連する蛋白を同定し、その機能を明らかにすることで、IMAの経気道散布の機序を解明することを目的とした。
この論文で使われている画像
