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プロテオームプロファイリングによるヒトがん細胞株の腫瘍モデルとしての評価に関する研究

髙橋, 知里 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23136

2021.03.23

概要

ヒトがん由来の細胞株は、がんを理解するためのモデルとして、抗悪性腫瘍薬の開発の諸段階において広く利用されている。細胞株と腫瘍の間には多くの類似点が見出され、がん細胞株を使用して、疾患における制御が緩和された遺伝子やシグナル伝達経路に関する情報が多く報告されている。しかし、最初のがん細胞株が開発されて以来、これらのモデルの臨床的妥当性は、絶えず議論されてきた。元の腫瘍とそこから派生したがん細胞株との間には、完全ではないがゲノム類似性があるとされ、元の腫瘍と比較した場合、がん細胞株は抗がん剤に対して同様の反応を示すことが報告されている。これまで、これらの細胞株の臨床的妥当性は遺伝子発現の比較によって行われることが多く、タンパク質発現を比較した報告は少ない。本研究では、24種の乳がん細胞株と腫瘍組織のプロテオームおよびリン酸化プロテオームを大規模に計測し、そのプロファイルについて腫瘍組織との相関を調べ、腫瘍モデルとしての妥当性について評価した。また近年、乳がん治療においては"intrinsic subtype"(内因性サブタイプ) の概念が実臨床に取り入れられており、治療方針決定の指標となっている。その中でも、2001年にSorlieらが乳がんのmicroarrayによるmRNA発現プロファイル解析により、乳がんには複数のサブタイプがあり、それが乳がんの治療選択の為のホルモン受容体と HER2 発現による分類と適合することを報告した。このmicroarrayデータから各サブタイプに対する signature遺伝子を 50個抽出したパネルは、PAM50 と呼ばれている。PAM50分類では、乳がんはLuminal A、luminal B、HER2-enriched、ba sal-likeとnormal-likeに分類される。乳がん由来の細胞株24 試料のプロテオームおよびリン酸化プロテオームプロファイルを計測し、ヒト乳がん組織77試料のプロテオームプロファイルおよび105試料のリン酸化プロテオームプロファイルを既報から収集して階層的クラスタリングを行ったところ、細胞株と組織は混じりあうことなくクラスタリングされた。さらに、PAM50分類のためのプロテオームおよびリン酸化プロテオームマーカーを同定し、これらの直接乳がんに関係していると考えられる分子のみを用いた階層的クラスタリングを行った。その結果、細胞株試料と腫瘍組織試料が PAM50分類クラスターにまとまって分類されることはなく、乳がん細胞株は腫瘍組織とは異なるプロテオームおよびリン酸化プロテオームプロファイルを有していることがわかった(第1章) 。

リン酸化酵素(キナーゼ)によるタンパク質のリン酸化修飾は、細胞増殖、分化、代謝など、生体内で起こる様々な生命現象に深く関わっており、多くの細胞機能を制御している。したがって、特定の疾患に特徴的なタンパク質リン酸化修飾を引き起こすキナーゼを見つけることは創薬標的探索の観点からも非常に重要である。近年、液体クロマトグラフィー/ タンデム質量分析( LC/MS/MS)とリン酸化ペプチド濃縮法の組み合わせにより、一度の分析で数千個のリン酸化修飾部位を同定することが可能となった。しかし、これらのリン酸化修飾部位の多くは、その生物学的機能が十分に解明されていないのが現状である。そのため、リン酸化修飾を担ったキナーゼに情報を収斂させるアプローチが望ましいと考えられる。本研究では、キャピラリーLC/トリプル四重極質量分析計を用いて、選択反応モニタリング( SRM)モードでキナーゼ由来のリン酸化ペプチドを定量する分析システムを開発した。標的ペプチド配列は、研究室内で有するリン酸化プロテオームライブラリーとキナーゼ活性を調節するリン酸化修飾部位に関する文献情報を用いて選択した。本手法を細胞由来試料に適用し、細胞内の標的キナーゼの活性をプロファイルしたところ、過バナジン酸処理後の細胞
内キナーゼ活性の変動を測定することに成功した(第2 章)。

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