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光誘起電子移動を作働原理とする可視光励起光ラベル化剤群の開発

井上, 大輝 東京大学 DOI:10.15083/0002005153

2022.06.22

概要

■ 背景・目的
 光ラベル化剤とは,暗所では安定であるが光照射を受けると活性種を産生し,タンパク質などの生体分子と反応して共有結合を形成する分子である.代表的な光ラベル化剤として,アジド,ジアジリン,ベンゾフェノンが挙げられ,薬剤と相互作用するタンパク質の同定法であるphotoaffinity labelingに利用されている.既存の光ラベル化剤は,いずれも活性種産生に紫外光を要するため,DNA損傷[1]やROS産生[2]など細胞への障害が避けられない.可視光で機能する光ラベル化剤が開発されれば,より温和な条件での光ラベル化となるだけでなく,異なる波長の光によって複数の時刻,空間での光ラベル化も可能となり,生命科学研究に有用なケミカルツールになり得ると考え,本研究において可視光励起光ラベル化剤群の開発を目指した.

■ 分子設計:光誘起電子移動を駆使したカルベン産生
 ジアゾ基は,紫外光により励起され活性種カルベンを産生することが知られている.修士課程では,ジアゾ基の共役系をcoumarinに組み込んだ光ラベル化剤を設計,評価し,400nmの光で機能することを示した.更なる長波長化を目指し,coumarinよりも長波長光を吸収するrhodamineやrhodolを母核としたが,それぞれ暗所で不安定であり,更なる長波長化は達成できなかった.そこで博士課程では,ジアゾ基が一電子還元によってカルベンを産生することに着目した[3].そのカルベン産生は“分子間の光誘起電子移動”による一電子還元によっても進行することが報告されている[4](Figure1-a).一方で,fluoresceinやrhodamineに代表されるようなxanthene系色素は,可視光を吸収するxanthene部位と,benzene部位の共役系が独立している.そのため,色素によってはxanthene部位の励起によってxanthene部位からbenzene部位へ一電子移動する“分子内の光誘起電子移動”が起こることを当研究室で見出してきた[5](Figure1-b).これら2つの知見を受け,ジアゾ基からのカルベン産生はxanthene系色素の“分子内の光誘起電子移動”による一電子還元によっても進行すると考え,可視光励起光ラベル化剤となることを期待した.

■ 可視光励起光ラベル化剤群の開発
 先述の分子設計に則り5A2Me-Fluoおよび5DA2Me-Fluoを設計,合成した(Figure2-a).光学特性を取得したところ,吸収スペクトルに変化は認められず(Figure2-b),ジアゾ化により低蛍光性となることが分かった(Figure2-c).前述したように,fluorescein誘導体の中には光誘起電子移動を消光原理とする弱蛍光性誘導体が存在し,その蛍光量子収率とbenenze部位のLUMOエネルギーとの間に相関があることが知られている[5].実際,5DA2MeのLUMOエネルギーは光誘起電子移動が起こる閾値を超えており,ジアゾ化による消光は光誘起電子移動に因ることが強く示唆された(Figure2-d).続いて,493nmの光照射によって光反応が進行するかを検証したところ,光照射依存的に5DA2Me-Fluoが消失し,ジアゾ基がヒドロキシ基となった光反応生成物が認められた(Figure2-e).また,各光照射時間ごとに蛍光スペクトルを取得したところ,光照射時間依存的に蛍光強度が増大することが明らかとなった(Figure2-f).これは低蛍光性の5DA2Me-Fluoから,強蛍光性の光反応生成物が生成したことに起因すると考えられる.最後に,タンパク質を光ラベル化できるかを精製タンパク質BSAを用いて検証した.結果,光照射を行った場合にのみBSAのバンドから蛍光が認められ,5DA2Me-Fluoが光ラベル化剤として機能することが明らかとなった(Figure2-g).また,更なる長波長化を目指し,色素母核をrhodamineまたはSi-fluoresceinに変更したところ(Figure2-h),それぞれ550nm,600nmの光依存的にBSAをラベル化し,可視光励起光ラベル化剤群の開発に成功した.

■ PhotoaffinityLabelingへの応用
 次に,開発した光反応反応性基がphotoaffity labelingに適用できるかを検証した.標的タンパク質は CA Ⅱ(carbonic anhydrase Ⅱ),リガンドはsulfonamideを採用し,リンカー長の異なるプローブを計3種類合成した(Figure3-a).精製CAⅡに対プローブで最も強い蛍光が認められた(Figure3-b).続いて,living RBCs(red blood cells)の内在性CAⅡを選択的に光ラベル化できるかを検証した.結果,living RBCsの内在性CAⅡを選択的に光ラベル化することができ,そのバンドは阻害剤EZA(ethoxzolamide)の存在下で消失することを確認し,開発した光ラベル化剤が生細胞に適用できることを示した(Figure3-c).

■ 一細胞蛍光標識への応用
 これまでの検討より,5DA2Me-Fluoは光照射依存的に蛍光性を回復し(Figure2-f),同時にタンパク質をラベル化する特性を有することが分かっている(Figure2-g).これを活かし,一細胞蛍光標識に応用できると考えた.Helacellsに5DA2Me-Fluoを添加した後,一細胞だけに488nm光照射を行うことで,一細胞を選択的に蛍光標識できることを示した(Figure4-a).また,視野全体に光照射を行った後にMeOH固定をしたところ,固定後も蛍光シグナルが認められ,細胞内のタンパク質を光ラベル化することで細胞内滞留性を獲得することが示唆された(Figure4-b上段).

■ 総括・展望
 本研究において,光誘起電子移動を駆使することで500~600nmの光で機能する光ラベル化剤群の開発に成功した.さらに,生細胞中の内在性CAⅡを選択的に光ラベル化できること,一細胞蛍光標識に応用できることを示した.今後は,異なる波長の光によって複数の時刻,空間での光ラベル化を行い,オミックス解析や細胞系譜解析などに応用していきたい.

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