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Close association of polarization and LC3, a marker of autophagy, in axon determination in mouse hippocampal neurons

世木, 直喜 名古屋大学

2022.12.22

概要

【緒言】
オートファジーは、細胞内小器官、高分子などの細胞内クリアランスシステムであり、細胞の恒常性維持だけでなく、分化などのより活発な細胞活動を行うために不可欠なものである。ニューロン軸索の伸長過程では、オートファジーは成長円錐で優先的に起こり、その破綻は中枢神経系における損傷後の軸索再生不能と密接に関連している。しかし、ニューロン成長過程におけるオートファジーの役割は不明な点が多く、特にニューロンの極性獲得、すなわち軸索決定にオートファジーが関与しているかどうかは不明である。本研究の目的は、ニューロンが形態的極性を獲得する際のオートファジーの生物学的意義を検討することであり、このためにオートファジーのマーカーであるLC3 (MAP1LC3: Microtubule-associated protein lightchain 3)を利用した。

【対象及び方法】
C57BL/6JマウスまたはGFP-LC3トランスジェニックマウス胎児(E17または18)の初代培養海馬ニューロンを用いた。ニューロンはpoly-D-lysineとlamininで処理したglass base dish上で、B-27Plus、GlutaMAX、Antibiotic-Antimycoticを加えたNeurobasal Plus培地にて培養し実験に使用した。

免疫細胞化学では、ニューロンを10分間4%PFA固定し、1分間－30℃メタノール透過処理してから間接蛍光抗体法による標識を行った。ニューロン特異的クラスIIIβチューブリン(Tuj1)、LC3、および軸索のマーカーであるTauの染色を行った。画像は共焦点レーザー顕微鏡TiEA1R(Nikon)で撮影し、Plan Apo VC60×AWIDICN2水浸対物レンズ(N.A.=1.2、Nikon)を使用した。

生細胞イメージングはTiEA1R、Plan Apo 40×DICMN2対物レンズ(N.A.=0.95、Nikon)を用い、5分毎に連続撮影した。取得したデジタル画像は、ImageJ(NIH)を用いて処理・解析した。

【結果】
初代培養ニューロンにおいてオートファゴソームのマーカーであるLC3Bの免疫染色を行った。未熟なステージ1のニューロンでは、LC3Bは均等に分布していた(図1A)。対称形で軸索が定まっていないステージ2ニューロンでは、LC3Bの局在に関して、極性化したもの(図1A、中段)と極性化していないもの(図1A、下段)が観察された。約20%を占めた極性化したものでは、LC3Bは単一の突起に濃縮されていた(図1Bから図1D)。

GFP-LC3トランスジェニックマウスから得られたニューロンを生細胞イメージングで観察すると、ステージ2ニューロンではLC3が神経突起間を振動的に分布していることがわかった。しかしある時、単一の突起にGFP-LC3シグナルの急激な増大(LC3サージ)が発生し、LC3の急増に伴ってその突起が伸長し、ニューロンが極性を獲得することがわかった(図2A、B)。また、軸索マーカーTauによる免疫染色によって、LC3サージ後に伸長した突起が軸索に分化したことが確認された。さらに、ステージ2神経突起のGFP-LC3相対輝度を解析した結果、将来の軸索はその他の突起よりも有意に高い輝度を有していることが示された(図2C)。

ニューロンのオートファジーを強制的に活性化するため、天然由来の二糖であるトレハロースを利用した。ステージ2ニューロンを25mMトレハロースで処理し、神経突起のオートファジーが誘導されることを確認した。最長突起および2番目に長い突起の長さの比によって表したニューロンの形態では、トレハロースは最長突起の伸長を有意に促進した(図3A)。対照的に、リソソームとオートファゴソームの融合を阻害することでオートファジーを阻害するバフィロマイシンA1でニューロンを処理すると、最長突起の伸長が抑制され、トレハロースによる伸長も打ち消された(図3A～C)。さらに、突起の生物学的特性を評価するため、Tauのpolarity index(PI)を算出した。PI=(Id-Ia)/(Id+Ia)［Id：樹状突起の平均輝度、Ia：軸索の輝度］で、PI>0またはPI<0は、それぞれ樹状突起または軸索への分極を示す。トレハロースはPIを有意に減少させ、バフィロマイシンA1はPIを有意に増加させた。さらに、トレハロースの効果はバフィロマイシンA1によって打ち消された(図3D)。

【考察】
これまでの研究で我々は軸索損傷後のオートファジーの役割を明らかにした。すなわち、コンドロイチン硫酸が受容体PTPσを活性化させ、コータクチンのチロシン脱リン酸化を誘導し、オートファゴソームとリソソーム間の融合が減少することによって、切断された軸索遠位端にオートファゴソームが異常に蓄積し、再生活性の低い状態に変化する。これらの知見から、より未熟なニューロンの軸索決定におけるオートファジーの役割について調査した。

この問題のために、初代培養海馬ニューロンという確立されたモデルを利用した。GFP-LC3トランスジェニックマウス由来のニューロンについての生細胞イメージングに基づくと、単一の突起にGFP-LC3が特異的に集積し数時間持続し、その後その突起が軸索へと伸長することがわかった(図2)。この結果から、軸索の決定には突起におけるオートファジーの非対称的な活性化が関与していることが示唆された。

オートファジーがどのように1本の突起を軸索に決定したか、今回の研究では明らかにならなかった。ひとつの仮説は、オートファジーが軸索決定に必要な局所ポジティブシグナルを調節しているというものである。例えば、Trkファミリータンパク質は突起先端に局在し、NT-3やBDNFなどのニューロトロフィンによる活性化が、Ras経路やPI3K-AKT経路を介して軸索決定を促す。エンドサイトーシスされたTrkは、微小管上を逆行性に輸送されるが、このTrkの逆行性輸送がTrkの活性化に重要であることが示されている。また、BDNFで活性化されたTrkBがエンドサイトーシスされたのちにオートファゴソームにトランスロケーションされることが、ニューロンが生体内で複雑性を獲得するために重要であることが明らかになった。したがって、軸索決定時のTrkシグナルの制御には、局所的なオートファジーとその逆行性輸送が関与している可能性がある。

【結語】
軸索が決定する前のステージ2ニューロンでは突起間でオートファゴソームの偏在があること、GFP-LC3トランスジェニックマウスニューロンの生細胞イメージングにより「LC3サージ」が単一の未熟神経突起の軸索への分化を促進することを示した。さらに、トレハロースとバフィロマイシンA1によるオートファジーの薬理学的活性化および阻害は、それぞれ軸索の決定を加速および遅延させた。以上のことから、発達中のニューロンにおいて、オートファジー、そのマーカーであるLC3と軸索決定が密接に関連していることが明らかとなった。

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