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高メチル化制御を受けるFOXB2遺伝子のヒト膵臓腺癌由来細胞株Panc-1における機能解析

福地, 大樹 フクチ, ヒロキ 神戸大学

2020.03.05

概要

Forkhead box(FOX)ファミリータンパク質は酵母からヒトに至る様々な生物種で保存された転写因子であり、発生過程における機能等が報告されている。今日までに、FOX 遺伝子ファミリーの癌細胞における機能は数多く報告されているが、FOXB2 遺伝子に関してはほとんど報告がない。

我々は、ヒト膵臓腺癌由来細胞株の一つであるPanc-1 細胞において、FOXB2 遺伝子の 5’上流にあるCpG リッチな領域が高度にメチル化され、発現が抑制されていることを発見した。この発見から、Panc-1 細胞ではおそらくエピジェネティックな制御を介して FOXB2 遺伝子の発現が抑制されていることが示唆された。癌細胞におけるエピジェネティック制御 による発現抑制は、癌抑制遺伝子不活化の主要なメカニズムの一つであることから、FOXB2遺伝子には癌抑制遺伝子のような働きがあるのではないかと推測した。そこで本研究では、 Panc-1 細胞に FOXB2 遺伝子を過剰発現させた系において、Panc-1 細胞に対する影響を解析した。

まず始めに、FOXB2 の安定発現株 2 クローンと、コントロールとして空ベクターを導入した1クローンを得た。得られたクローンの細胞形態を観察したところ、コントロールクローンと比較して、FOXB2 安定発現株では丸く細長い形態を示した。この形態変化は細胞接着が弱くなったためであると考え、スフェロイド形成能を確認した。スフェロイドとは細胞凝集塊であり、細胞接着能を評価する一つの方法として有効であると考えられ、Panc-1細胞はスフェロイドを形成することが既に先行研究により確認されている。スフェロイド形成能を確認したところ、コントロールクローンは先行研究の報告と同様にスフェロイドを効率よく形成したが、FOXB2 安定発現株はスフェロイド形成能が低下した。以上の結果から、FOXB2 安定発現株では細胞接着能が低下していることが示唆された。そこで、細胞の裏打ちタンパク質であり、細胞接着に関与する β-catenin タンパク質に注目した。β-cateninタンパク質は細胞接着の他に、Wnt シグナル経路等に関与し、また様々な癌細胞において過剰発現が確認されている癌の悪性化とも関係が深いタンパク質である。β-catenin タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により確認したところ、FOXB2 安定発現株ではタンパク質発現量が顕著に減少していることが明らかとなった。しかしながら、mRNA レベルでは発現量に違いがなかったことから、FOXB2 安定発現株ではタンパク質分解機構が亢進していると考え、プロテアソーム阻害剤である MG132 を加えβ-catenin タンパク質量の回復を確認した。確認した結果、FOXB2 安定発現株においてタンパク質発現量の顕著な回復は確認できなかった。以上の結果から、FOXB2 安定発現株ではプロテアソーム非依存的な機構で、間接的に β-catenin タンパク質の発現量が抑制されていることが示唆された。

次に、スフェロイドは生体内の構造構築に近い環境を示すと言われているため、FOXB2安定発現株のスフェロイド形成能の低下は腫瘍形成能に影響を及ぼす可能性があると考え た。腫瘍形成能を in vitro の系で評価する有効な方法の一つとして、side population(SP) assayが知られている。このアッセイ系は腫瘍形成能が高い細胞は薬剤排出能力が高いことを利 用した手法であり、フローサイトメーターを用いてその細胞集団(SP 細胞)の割合を確認することができる。またβ-catenin タンパク質の発現量に関しても、SP 細胞ではそれ以外の細胞集団(non-SP 細胞)と比較して β-catenin タンパク質量が多いといった報告もあり、この点からもFOXB2 安定発現株は腫瘍形成能に影響を及ぼしている可能性があると考えた。このアッセイ系を用いてSP 細胞の割合を確認したところ、コントロールクローンに比べ、 FOXB2 安定発現株はSP 細胞の割合が顕著に低下していることが明らかとなった。また、 SP 細胞に多く発現するとされる薬剤排出ポンプのABC トランスポーターファミリーの一 つであるABCG2 の発現量がFOXB2 安定発現株では顕著に減少した。次に他の解析法として、軟寒天コロニー形成アッセイを行った。このアッセイ系は細胞の足場非依存的増殖能 を評価する系であり、腫瘍形成率が高い癌ではこの能力が向上していることが知られてい る。軟寒天コロニー形成アッセイを行ったところ、FOXB2 安定発現株ではコントロールと比較して足場非依存的増殖能が低下していた。以上の結果から、FOXB2 安定発現株では腫瘍形成能が低下していることが示唆された。

本研究により明らかとなった FOXB2 のPanc-1 細胞に対する影響を以下に示す。

① 細胞接着能の低下
② β-catenin タンパク質発現量の低下
③ Panc-1 細胞に存在する腫瘍形成能が高いとされる SP 細胞の割合低下
④ Panc-1 細胞の足場非依存的増殖能の低下

これらの結果から、FOXB2 安定発現株では Panc-1 細胞の悪性表現型が阻害されていることが示唆された。

本研究では、Panc-1 細胞を用いてこれまでに報告の少ないヒト癌細胞株における FOXB2遺伝子の機能の一端を明らかにした。FOXB2 の発現が確認できない癌細胞に強制発現させたときのフェノタイプではあるが、Panc-1 細胞の悪性化にとって阻害的な作用があり、 FOXB2 には癌抑制遺伝子のような機能があることが示唆された。今後は、実際にFOXB2を発現している細胞を用いて生理的な条件下での機能が解明されることが期待される。

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