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ヒト脂肪幹細胞、血管内皮細胞を搭載したリコンビナントコラーゲンペプチド(rhCP)による放射線障害組織の治療

増子, 貴宣 東京大学 DOI:10.15083/0002002485

2021.10.15

概要

放射線療法は種々のがんに対する標準治療として定着してきているが、放射線感受性は分裂の盛んな細胞ほど高いため、放射線は癌細胞のみならず正常組織の幹細胞も死滅させてしまう。こうして生じた放射線障害は、細胞増殖能の低下・阻血・線維化・萎縮といった組織の不可逆性変化を本態としており、自然治癒することなく、また条件の悪い創傷床であるため、外科的介入による二次再建や保存的治療を困難にし、難治となる。
　近年、こうした放射線障害組織に対する脂肪移植、あるいは脂肪由来幹細胞(adipose derived stem/stromal cells; ASCs)移植による組織肥沃化効果（創傷治癒能・神経機能・血流の改善効果）を示す報告が相次いでいる。しかし一方で、効果はいまだ不十分であり、再生細胞治療を念頭に置いた上での、培養や移植の方法に関する研究が求められている。
　そこで本研究では、細胞の機能を最大限に発揮させるためのバイオマテリアルとして、リコンビナントコラーゲンペプチド(recombinant human collagen peptide; rhCP)について検討を行った。rhCPはヒトコラーゲンⅠ型をベースに、インテグリンとの接着性に優れるRGD配列を多く含むコラーゲンマテリアルであり、培養や移植に際して細胞に足場を提供すると同時に、細胞機能を向上させることが期待されている。本研究は、脂肪移植による再生治療効果の根源とされるASCs、並びに血管内皮細胞(vascular endothelial cells; VECs)をrhCPの上で培養し、移植する治療の効果を検証することによって、放射線障害組織に対する根本的治療の開発を目指すものである。

【準備】
　rhCPは直径7mm、厚さ0.6mmのスポンジ型のものを使用した。このrhCPは水溶液の状態で凍結乾燥を行い製造することで、直径100μmの空孔を多数有する3次元構造体を呈していた。
　使用するASCsは、腹部や大腿部から脂肪吸引術を受けた健常成人女性15名（平均43.2歳）の脂肪組織から分離培養を行った。VECsは脂肪組織からの分離培養が容易ではないため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells; HUVECs)を購入し、使用した。

【培養条件の検討】
　rhCPへの細胞の搭載は、まず少量(60μl)の細胞懸濁液のみをrhCPに滴下し、2時間、37℃でインキュベートして細胞接着を促してから、十分な培養液を加える形で行った。走査電子顕微鏡やヘマトキシリン・エオジン染色による組織像を用いた観察では、rhCP上でのASCsの良好な接着性や、増殖性を確認できた。しかしASCsの局在に関しては、その多くはrhCPの表面部に生着しており、空孔を通ってrhCPの内部深くに生着したASCsはほとんど認めなかった。
　ヘキスト－PI(propidium iodide)二重染色によってASCsの生死判定を行い、さらに厚さ200μm3次元蛍光画像を再構成することで、rhCPに接着したASCsの概数をカウントした。種々の培養条件を検討した結果、1×105個のASCsをrhCP上に播種して5日間培養した場合に、良好な結果（生細胞数>5×104個、細胞生存率>95%）が得られることが分かった。播種細胞数をこれ以上増やしてもrhCPに接着する細胞は増えず、培養期間をこれ以上長くしてもむしろ細胞生存率が低下する傾向がみられたため、後述する動物実験では上記の培養条件を使用した。

【細胞機能の評価】
　次に、rhCP上とディッシュ上でそれぞれ2日間培養したASCsに対してマイクロアレイ解析を行い、細胞機能を遺伝子レベルで比較した。遺伝子オントロジー解析では、rhCPの上で培養したASCsにおいて、細胞周期、創傷治癒（特に細胞外マトリックス産生）に関連する遺伝子の発現上昇を認めた。さらにパスウェイ解析では、同じくrhCPの上で培養したASCsにおいて、細胞増殖促進、創傷治癒促進、炎症抑制を示す所見、さらに血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子βなどの成長因子の発現上昇を示す遺伝子発現パターンを認めた。
　興味深いことに、VEGFをはじめとするこれらの成長因子自体の遺伝子発現は、rhCPの上で培養したASCsにおいて上昇を認めなかった。つまり、rhCPが機能性足場として、成長因子と同様の効果をASCsに与えていたことが示唆されており、rhCPに搭載したASCsは培養の段階から、すでに創傷環境に置かれたかのようにその機能を高めていることが分かった。

【動物実験】
　そして、放射線障害マウスを用いて創傷実験を行った。免疫寛容マウスの背部皮膚に、吸入麻酔下で10Gray×2日間（計20Gray）の放射線を局所照射した。照射後4週間経過したマウスの背部皮膚は、肉眼的に色調の変化や弾力性の低下を呈し、マロリー・アザン染色による組織学的観察では皮膚・皮下の線維化、小血管の閉塞、皮下の萎縮、皮膚付属器の消失といった典型的な慢性放射線障害の所見を認めたため、これをもって放射線障害マウスモデルとした。
　12匹の放射線障害マウスの背部に直径6mmの皮膚全層欠損創を作成し、3匹ずつ4つの治療群に振り分けた。すなわち、(1)rhCP上で培養したASCs及びVECs、(2)rhCP上で培養したASCs、(3)rhCPのみ（細胞なし）、(4)正常対照群（無治療）、である。治療は創傷の作成直後に行い、細胞治療を行う1,2の群では、rhCPの細胞を搭載した方の面が、創面に接触する形で貼付した。治療経過を18日間観察したところ、(1)ASCsとVECs群＞(2)ASCs群＞(3)rhCPのみ群＞(4)正常対照群、の順に優れた創傷治癒過程を認めた。ASCsとVECs群は14日で、ASCs群は18日で創閉鎖に至ったのに対し、後2者では至らなかった。当研究室のこれまでの知見から、正常マウスに同じ創傷を作成した場合は18日以内に創は自然閉鎖するため、正常対照群の経過からは、放射線障害マウスにおける創傷治癒能の低下も確認できた。
　10日目の創傷面積の、初日に対する比率は(1)7.3%、(2)19.7%、(3)36.3%、(4)50.3%であり、統計解析では全ての群間において有意差を認めた。よってASCs、VEC、及びrhCPという全ての治療要素は放射線障害組織に対し再生治療効果を持ち、かつそれらの併用は相乗効果を生み出す、ということが分かった。

【考察】
　幹細胞が死滅・欠乏し、難治となった放射線障害組織は幹細胞補充療法の合理的なターゲットであり、その効果を最大限に高める方法を模索することが本研究の目的であった。rhCPを足場とした培養方法は、ASCsの細胞増殖、創傷治癒や炎症抑制に関する機能を向上させた。また、rhCPをそのまま細胞を保持する担体（キャリア）として使用したASCsとVECsの移植療法は、放射線障害マウスに対し、優れた創傷治癒促進効果を示した。ASCsによる細胞治療は広く研究されているところであるが、VECsの同時移植によって放射線障害組織に対する再生治療効果がさらに高まることを発見できたのは、大きな意義を持つ。以上の結果より、rhCPは単に培養や移植における足場を提供するだけでなく、細胞機能を高め、細胞治療の効果を最大限に引き出す機能性足場である、と考えることができる。
　そうしたrhCPの高い生物活性の機序としては、細胞増殖を促す受容体であるインテグリンとの接着性に優れるRGD配列を多く含むこと、が考えられる。インテグリンが成長因子の受容体を直接的に活性化する報告をした過去の研究は多く、本研究においてもインテグリン接着性の高さがASCsの機能向上につながった可能性が高いが、本研究では完全に解明できていない部分でもある。またASCsが空孔を通ってrhCPの奥深くに生着することが少ない問題については、空孔同士をつなぐ連通孔の不足に起因しており、製造過程の改良が必要と考えられた。
　今回研究した治療法のもう一つのメリットは、その実現可能性の高さである。rhCPは従来の動物由来コラーゲンとは異なり、遺伝子操作を加えたイースト菌から大量生産が可能であり、また免疫反応を起こす心配もないため安全性も高い。また実際の手技も、経皮的治療のため、局注や静注を必要とせず、低侵襲かつ簡便に行うことができる。そしてASCs、VECsといった細胞は、余剰脂肪の単純切除（もしくは脂肪吸引）という基本的手術によって安全かつ大量に入手可能である。以上を鑑みると、本法は幅広くかつ再現性の高い治療を実現しやすいという大きなメリットを持っており、今後は臨床応用に向けて詳細な研究を進めていきたい。

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