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後天性中耳真珠腫に対する診断および治療戦略とNotchシグナルに関する研究

福田, 篤 北海道大学

2022.03.24

概要

【背景と目的】
後天性中耳真珠腫は鼓膜の角化扁平上皮が中耳腔に侵入することにより発生する．中耳真珠腫は内部にkeratin debrisを溜めながら増大し，局所浸潤性で骨溶解により中耳および内耳破壊をもたらし，難聴，めまい，顔面神経麻痺などを引き起こす．頭蓋内に進展した場合には髄膜脳炎や脳膿瘍を合併し死亡する場合がある．根本的治療は外科的治療のみで，病変の根治，および聴力改善・維持を目指して鼓室形成術が施行される．本論文では，まず後天性中耳真珠腫における術後聴覚予後因子について明らかにし，次いでMRI検査による診断精度向上の試みについて検討する．さらに，後天性中耳真珠腫組織標本を用いてNotchシグナル関連分子の発現解析を行い後天性中耳真珠腫とNotchシグナルの関連を検討する．

【対象と方法】
2010年2月から2020年4月までに北海道大学病院耳鼻咽喉科で後天性中耳真珠腫（あるいは疑い症例）に対して手術が施行された症例を対象とした．
1. アブミ骨上部構造が残存しており耳介軟骨で伝音再建が施行できた一期的鼓室形成術症例を対象とした．EAONO/JOS合意案に従って病期（Stage）と進展度（STAMシステム）を評価した．聴力結果は，AAO-HNSの基準に従い，0.5・1・2・3kHzを用いて平均純音気骨導差（PTA-ABG）を算出した．術後1年以上2年未満の聴力結果を術後聴力結果として使用し，術後PTA-ABGが20dB以内を成功と定義した．年齢（60歳未満/60歳以上），病期（Stage I–IV），各解剖学的区分（STAM）への進展の有無，乳突部の蜂巣発育程度（MC0-1/MC2-3），アブミ骨病変の程度（S0/S1），術式（CWU/CWD），ツチ骨柄の有無，鼓索神経の有無，中耳粘膜の状態（正常/病変）について，術後聴力結果との関連について検討した．
2. 術前にnon-EP DWIおよびT1WIを含むMRIを実施した初回手術と再手術/段階手術症例を対象とした。MRIでの中耳真珠腫を診断するための2つの診断基準を定義した．基準1：中耳または乳突腔内のnon-EP DWIにおいて，脳組織の信号と比較して高信号であること，基準2：基準1の所見があり，T1WI像において大脳白質の信号と比較して同程度または低信号であること．最終診断は手術中の所見で確認した．各診断基準における診断精度について検討した．
3. 真珠腫組織を用いてPCR法によるNotchシグナル関連遺伝子の発現分析を行った．PFPE組織から厚さ10μmの切片を作成した．マイクロダイセクション法にて真珠腫および正常外耳道皮膚組織から上皮層を回収，mRNAを抽出し，84のNotchシグナル関連遺伝子のプライマーで構成されるRT2 mRNA PCR Array（RT2 Profiler™ PCR Array Human Notch Signaling Pathway, Qiagen）にてquantitative-realtime-PCRを施行し遺伝子発現解析を行なった．各遺伝子の転写レベルに関しては2つのハウスキーピング遺伝子を用いて標準化を行い，それぞれの∆Ct値を算出し，相対的mRNA発現比（Fold change）に関してはΔΔCt法に基づき計算を行った．また，手術時に採取した真珠腫組織を用いて免疫組織化学染色を施行した．FFPE組織を4μmの厚さで薄切し切片を作成し，抗Notch1，抗HES1，抗p53モノクローナル抗体を用いて免疫化学染色を施行した．いずれの実験も正常外耳道皮膚を対照とした．

【結果】
1. 解析対象は手術で真珠腫と確定診断を得た34名34耳であった．Stage IVの患者はいなかった．術後PTA-ABGが20dB以下は55.9％の症例に認められた．EAONO/JOS合意案の病期上昇に伴い術後聴力成功率は有意に低下し（p=0.025），アブミ骨病変の程度がS0（アブミ骨上部構造および周辺粘膜が正常）であることが有意な成功予測因子であった（p=0.014）．
2. 解析対象は53名57耳であった．57耳のうち46耳（80.7％）で中耳真珠腫が手術で確認された．non-EP DWIのみを用いた基準1では，全体の感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率は，それぞれ93.5，63.6，91.5，70.0％であり，全体の正診率は87.7％であった．non-EP DWIとT1WIを組み合わせた基準2では，全体の感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率は，それぞれ89.1，100，100，68.8％であり，全体の正診率は91.2％であった．
3. 真珠腫PFPE標本は男性5耳，女性1耳から組織を採取し作製した．対照群として，同患者からそれぞれの正常外耳道皮膚を採取しPFPE標本を作製した．84遺伝子のうち48の遺伝子発現を解析できたが，残りの36遺伝子については半数以上のCt値が欠損していたため解析ができなかった．真珠腫におけるNotch1の相対的発現比は最も低く，統計的に有意な差が認められた（p=0.042）．Notchシグナルの主要な標的の一つであるHES1の相対的発現比も減少していた（p=0.272）．Notch3の相対的発現比は増加していた（p=0.680）．真珠腫FFPE標本は男性28名，女性13から組織を採取し作製した．対照群として，手術を受けた他の男性4名，女性4名の8名の患者から正常外耳道皮膚を採取しFFPE標本を採取した．Notch1の発現陽性率は，真珠腫では48.5±32.4%，外耳道皮膚では83.4±17.5%であり，Notch1の発現に統計学的に有意な差が認められた（p<0.001）．HES1の発現陽性率は，真珠腫で44.9±17.8％，外耳道皮膚で55.7±7.1％であり，統計学的に有意な差が認められた（p<0.01）．p53の発現陽性率は，真珠腫では8.5±11.4%，外耳道皮膚では0.5±0.7%であり，統計学的に有意な差が認められた（p<0.001）．

【考察】
1. 後天性中耳真珠腫に対する鼓室形成術の術後聴力成績に対して，EAONO/JOS合意案の病期が低いこと，アブミ骨周囲に病変が及んでいないことが有利に働く重要な因子であることが示された．病期は中耳真珠腫が初発部位を越えて隣接区分に進展することで進行し，また，病期が進行することでアブミ骨病変の程度も悪化しやすい．従って，有効な聴覚を温存するためには，早期に手術を行うことが重要と考えられた．
2. 中耳真珠腫のMRI診断においてT1WIは偽陽性の除外に有用であり，non-EP DWIとT1WIの組み合わせは，non-EP DWIのみと比較して，特異度と正診率の向上が期待できることが示された．non-EP DWIとT1WIを合わせたMRI検査は，中耳真珠腫の正確な早期診断に寄与すると考えられる．
3. 真珠腫組織におけるNotch1遺伝子の発現，Notch1とHES1の発現は，正常外耳道皮膚に比べて有意に低下していた．Notchシグナルは，ケラチノサイトの増殖停止と分化を導くことが報告されているが，真珠腫におけるNotch1とHES1の発現低下は，ケラチノサイトが分化から増殖へとバランスを変化させ，病的状態の原因となっている可能性がある．

【結論】
1. 中耳真珠腫に対して有効な聴覚を温存するためには，病期が進行する前に早期に正確な診断を行い，鼓室形成術を行うことが重要である．
2. 鼓膜所見だけでは中耳真珠腫の診断が困難な場合は，non-EP DWIとT1WIを組み合わせたMRI検査も行うことで，中耳真珠腫を正確に早期に診断することが可能となる．
3. 中耳真珠腫ではNotch1–HES1シグナル経路の発現が低下する傾向が示され，細胞の分化から増殖方向へとバランスを変化させ，病的状態の原因をもたらしている可能性が考えられる．

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