抗癌剤ゲフィチニブによる副作用発症機構の解明及び新規抗腫瘍作用の探索
概要
抗癌剤ゲフィチニブによる
副作用発症機構の解明及び
新規抗腫瘍作用の探索
令和 4 年度
博士論文
東北大学大学院薬学研究科
生命薬科学専攻
関口
雄斗
目次
略語 p.3
序論 p.4
結果
第 1 章:分子標的薬ゲフィチニブによる副作用発症機構の解明 p.12
第 2 章:分子標的薬ゲフィチニブによる新規抗腫瘍作用の探索 p.32
第 2 章第 1 部:ゲフィチニブによる Fas 誘導性アポトーシス増強機構の解明 p.32
第 2 章第 2 部:ゲフィチニブによる癌細胞転移抑制機構の解明 p.39
考察 p.65
結論 p.73
実験材料及び実験方法 p.74
参考文献 p.93
発表論文リスト p.103
謝辞 p.104
2
略語
本文中及び図表中では、以下の略語を使用した。
TKI: Tyrosine kinase inhibitor
EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor
TNF-α: tumor necrosis factor-α
IL-6: Interleukin-6
IL-1β: Interleukin-1β
NLRP3: NLR family pyrin domain containing 3
ASC: Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
Caspase: cysteine-aspartic proteases, cysteine aspartases or cysteine-dependent aspartate-directed
proteases
SFKs: Src family kinases
FADD: Fas associated death domain protein
MMP: Mitochondrial membrane potential
CHX: cycloheximide
DMEM: Dalbecco’s modified Eagle’s medium
EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid
FBS: fetal bovine serum
PBS: phophate-buffered saline
PCR: Polymerase chain reaction
qRT-PCR: quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction
SDS: sodium dodecyl sulfate
BSA: bovine serum albumin
3
序論
癌は過去 20 年以上にわたって、日本人の死亡原因の第 1 位を占めており、現在では約 3
人に 1 人が癌で死亡する。また、日本人の 2 人に 1 人が生涯のうちに何らかの癌になると
言われており、日本人にとって非常に身近な疾患である。世界的にみても、年間 960 万人
が癌により死亡しており、世界で 2 番目に多い死因となっている。したがって、癌の克服
を目指す研究は社会的要請の高い研究課題である。
現在、癌の治療には①手術療法、②放射線療法、③化学療法(抗癌剤)、④免疫療法の
4 つが主に行われており、これらは癌の 4 大治療法と呼ばれている。それぞれの治療法に
はメリット・デメリットが存在し、癌の性質や進行期によって1つもしくは組み合わせで
最も適した治療法が選択される。そのため、各治療法の進展・発展は癌治療の発展に繋が
る。
抗癌剤には、細胞障害性抗癌剤(白金製剤等)、分子標的薬(チロシンキナーゼ阻害薬等)、
ホルモン療法薬等が存在する。中でも分子標的薬は癌の原因となっている特定の分子だけ
を標的とするため、従来の細胞障害性抗癌剤と比較して正常な細胞へのダメージが少なく、
副作用の少ない薬として期待されている。
チロシンキナーゼは、主に細胞の増殖に必須の役割を果たす因子として知られている。
一方で、様々な癌細胞においてチロシンキナーゼの機能獲得型変異が認められており、癌
の発症・進展に深く関与することが知られている 1,2。そのため、チロシンキナーゼは癌の
有効な治療標的として考えられており、これまでに様々なチロシンキナーゼを標的とした
30 種類以上のチロシンキナーゼ阻害薬(TKI: Tyrosine kinase inhibitor)が開発されてきた。
臨床現場でも汎用されている TKI の細胞応答を解析することは副作用リスク等を理解する
上で重要な研究課題である。私は、TKI の中でもゲフィチニブに着目した研究を行ってい
る。
4
ゲフィチニブ(商品名:イレッサ)は、上皮成長因子受容体(EGFR: Epidermal Growth
Factor Receptor)のチロシンキナーゼ活性を選択的に阻害することで抗腫瘍作用を示す分子
標的薬である 3。開発当初、ゲフィチニブは従来の抗癌剤とは異なる癌細胞特異的な作用
メカニズムを有する医薬品として、治療効果と安全性の高さが期待され、2002 年に世界に
先駆けて日本において承認された。しかし、使用が拡大していくにつれて副作用の報告が
相次ぎ、結果的には 1-10%未満という高頻度で重篤な間質性肺炎を発症させることが判明
した 4。間質性肺炎の発症により公式発表だけでも 834 人の死者が短期間で確認され、被
害者遺族が訴訟を起こすなど日本の歴史に残る薬害として注目を集めた。ゲフィチニブは、
現在も日本を含む約 90 カ国において EGFR 遺伝子変異陽性非小細胞肺癌に対して用いら
れているが、間質性肺炎の詳細な発症機序は不明である。そのため、副作用発症機序解明
の社会的ニーズは高く、これまでに数多くのグループによって研究が行われてきた。しか
し、間質性肺炎のような重度の炎症病態の発症を説明できる炎症誘導機構については未だ
明らかにされていない。
間質性肺炎は、特定の医薬品やウイルス感染などによって肺の免疫系が過剰活性化し、
炎症が惹起されることで発症する。炎症が進むと肺胞壁が肥厚し、呼吸困難や呼吸不全と
いった肺機能の低下を引き起こす。特に、免疫細胞の間質への浸潤と、それに伴う TNF-α,
IL-6, IL-1β などの炎症性サイトカイン量の増加が、病態形成に重要な役割を果たしている
ことが知られている 5。そこで当研究室では、ゲフィチニブが炎症を誘導する性質を持つ
と予想し、免疫担当細胞であるマクロファージにおけるゲフィチニブの炎症誘導機構の解
明を目的として解析が進められた。その結果、ゲフィチニブはマクロファージにおいて、
ミトコンドリアの恒常性を撹乱し、パターン認識受容体の一種であり、ミトコンドリア
障害を認識する NLRP3 インフラマソームと呼ばれる免疫システム複合体の活性化を
介して炎症性サイトカイン IL-1β の分泌を誘導するという炎症誘導機構が明らかとな
った(図 1:令和元年度工藤勇気博士論文より一部引用)。しかし、ゲフィチニブのミ
トコンドリア恒常性を撹乱するメカニズムや標的分子については明らかにされておら
5
ず、ゲフィチニブによる間質性肺炎の発症に NLRP3 インフラマソームの活性化が関与
するか否かについても明らかにされていない。そこで私は、ゲフィチニブがミトコン
ドリア恒常性を撹乱する詳細なメカニズムと、ゲフィチニブによる間質性肺炎の発症
に NLRP3 インフラマソームの活性化が関与するか否か明らかにすることを目的とし
て研究に着手した。
Macrophage
Inflammatory
side effects
Gefitinib
Extracellular
Intracellular
Mitochondrial
damage
Mature IL-1β
ROS
NLRP3
Inflammasome
Activated
caspase-1
図1: ゲフィチニブによる炎症誘導機構
NLRP3 インフラマソームは、病原体感染や内因性の代謝物、薬物などに応答して ASC・
Caspase-1 と複合体を形成し、IL-1β の切断・放出を誘導することで炎症を惹起する 6–11。免
疫応答としての NLRP3 の活性化は生体防御に必要な働きをするが、過剰かつ慢性的な
NLRP3 の活性化は動脈硬化、痛風、2型糖尿病、アルツハイマー病といった様々な炎症性
疾患の発症に寄与することが知られている 12–17。そのため、NLRP3 インフラマソームは魅
力的な治療ターゲットとして世界中で注目され、その阻害剤開発のための研究が盛んに進
められている 18。NLRP3 インフラマソームの活性化上流の細胞内イベントとしてミトコン
6
ドリア障害が関与すると報告されている 19,20。ミトコンドリア障害が関与する NLRP3 活性
化メカニズムの一つとしてミトコンドリア DNA の細胞質放出が知られている。ミトコン
ドリア障害によりミトコンドリア ROS の産生量が増加すると、ミトコンドリア DNA の酸
化・断片化が誘導され、ミトコンドリア DNA がミトコンドリア内から細胞質に漏出する。
漏出したミトコンドリア DNA が NLRP3 に結合することで NLRP3 の活性化が誘導される
ことが知られている 21。
Src family kinases(SFKs)は、細胞膜に局在する非受容体型のチロシンキナーゼであり、
細胞の分化、増殖、生存、細胞接着、細胞形態、運動性において重要な役割を担っている
22
。ヒトゲノムに存在する SFKs は 11 種類あり、そのうち 8 種類(c-Src, Fyn, Lyn, Hck, Yes,
Blk, Fgr, Lck)がよく知られている 23。c-Src, Fyn, Yes はユビキタスに発現しているが、Lyn,
Hck, Blk, Fgr は単球やマクロファージに発現しており、Lck はリンパ球に発現している。
SFKs のうち Fgr, Fyn, Lyn, c-Src がミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアの機能に重要
な役割を果たしている
24–29
。本研究では、ゲフィチニブがミトコンドリア SFKs の活性化
をオフターゲット作用として阻害し、NLRP3 インフラマソームの活性化を誘導しているこ
とが明らかとなった。
一方で、ゲフィチニブの抗腫瘍作用として細胞増殖抑制、細胞死亢進、転移抑制が知ら
れているが、ゲフィチニブが細胞増殖を抑制できないゲフィチニブ抵抗性細胞においても
ゲフィチニブによる転移抑制作用が見られるといった報告もあることから、ゲフィチニブ
の抗腫瘍作用には EGFR 阻害作用だけでは説明できない部分が存在する 30。また、ゲフィ
チニブが EGFR 以外の分子に作用するといった報告も存在し、ゲフィチニブの抗腫瘍作用
に EGFR 阻害以外の因子の寄与が示唆されている
31,32
。ゲフィチニブの抗腫瘍作用機構を
正しく理解することは、ゲフィチニブの適応拡大や優れた抗腫瘍剤の開発に繋がる。そこ
で私は、ゲフィチニブによる EGFR 阻害以外の新たな抗腫瘍作用機構を解明することを目
的として、ゲフィチニブの癌細胞に対する細胞応答を解析した。その結果、EGFR の阻害
を介さずに、ゲフィチニブが誘導する抗腫瘍作用として、Fas 誘導性アポトーシス亢進作
7
用と p62/NBR1 による液−液相分離を介した癌細胞の転移抑制作用という、全く新しいゲフ
ィチニブの抗腫瘍作用を同定した。
Fas は細胞膜に位置するデスレセプターの一種であり、そのリガンドである Fas リガン
ドが結合するとアダプター分子の FADD やプロテアーゼの Caspase-8 がリクルートされ、
細胞死シグナルを伝達する複合体が形成される。その後、Caspase-8 の切断活性化に続き、
Caspase-3 が切断活性化されることでプログラム細胞死であるアポトーシスが誘導される
33
。デスレセプター下流では、細胞死シグナルと細胞生存シグナルが伝達され、その両シグ
ナルのバランスによって細胞は生存か死の運命が決定される 34。
Fas 誘導性アポトーシスは、細胞障害性 T 細胞等が癌細胞といった不要な細胞を効率的
に除去する際に使用する機構である 35。しかし、多くの癌細胞が Fas 誘導性アポトーシス
に耐性を示し、癌の発症・増悪に寄与することが知られている
36,37
。そのため、癌細胞の
Fas 誘導性アポトーシス耐性を克服することは癌治療を考える上で非常に重要な研究課題
である。
癌に対する治療は、外科的切除や放射線照射による根治的治療法等、局所における癌の
コントロールは良好になってきているが、遠隔に転移した癌に対しては効果的な治療法は
確立されていない。そのため、癌での死亡の約 90%に転移が関わると言われている 38。つ
まり、癌細胞の転移の阻止は癌治療において最重要課題であると言える。
癌細胞の転移は、癌細胞の原発巣での増殖、原発巣からの、離脱と脈管(血管やリンパ
管)への浸潤、脈管内での移動、転移臓器の血管内皮への接着、転移臓器への浸潤、転移
臓器内での増殖などの過程から構成されており、すべての過程が連続的に起こった結果生
じることが知られている
38
。そのため、癌細胞の転移には、癌細胞の遊走能や浸潤能が重
要な役割を果たしていることが知られている 39,40。
p62(別名:SQSTM1)は、細胞内のアミノ酸量や酸化ストレスに応答する多機能なスト
レス応答分子として知られている 41。分子内に PB1(Phox1 and Bem1p)ドメイン、ZZ(ZZtype zinc finger)ドメイン、TB(TRAF6-binding)ドメイン、LIR(LC3-interacting region)、
8
KIR(Keap1-interacting region)、UBA(ubiquitin-associated)ドメインといった多数のドメイ
ンを持ち、PB1 ドメインを介した自己凝集やさまざまな分子との相互作用による細胞内シ
グナル伝達の調節、LIR ドメインを介したオートファジーの誘導、KIR ドメインを介した
Nrf2 の活性化、UBA ドメインを介するユビキチンに依存したタンパク質凝集体形成への
関与など、多彩な生理機能を発揮すると考えられている
42
。また、p62 は癌や神経変性疾
患、生活習慣病や炎症性疾患など、数多くの疾患との関連が報告されている分子であり、
当研究室でも、p62 依存的な核内 ALIS(aggresome-like induced structures)が神経変性疾患
に関与することが知られている非典型的細胞死のパータナトスを促進する機能を持つこと
を報告している 43–46。
NBR1(neighbor of BRCA1)は、分子内に PB1 ドメイン、ZZ ドメイン、CC(Coiled-coil)
ドメイン、LIR ドメイン、UBA ドメインを持ち、p62 と似たドメイン構造を有しており、
機能的にも p62 と同様にタンパク質凝集体形成に関与することが知られている 47,48。p62 と
比較して NBR1 の研究は未だ途上であり、未解明な点が多く残されている。
p62 と NBR1 によるタンパク質凝集体は、不良タンパク質などをオートファジーにより
分解するために、一時的に隔離する役割があることが知られている
49
。しかし近年、生物
学分野において、液-液相分離の概念が普及したことでタンパク質凝集体への捉え方が変化
してきている。液-液相分離は分子が均一に混ざりあった状態から2相の区別できる液体に
分離する現象であり、ドレッシングの油滴に見られるように我々の日常にありふれた現象
であるが、近年、細胞内においても、分子の発現量増加などによって、液-液相分離を引き
起こした分子凝集体が数多く報告され、分子機能を効率的に発揮するための膜のないオル
ガネラであると考えられている
52,53
50,51
。また、p62 も液滴を形成することが報告されている
。本研究では、ゲフィチニブによって p62 と NBR1 の液滴形成が促進され、その液滴中
に cIAP1 が集積していることが明らかとなった。
cIAP1(Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein 1)は、IAP ファミリーに属し、3 つの BIR
(baculovirus IAP-repeat)ドメイン、UBA(Ubiquitin-associated)ドメイン、CARD(Caspase
9
activation and recruitment domains)ドメイン、RING(really interesting new gene)ドメインを
有する E3 ユビキチンリガーゼである。細胞運動に重要な役割を果たす Rac1 に K48 型ポリ
ユビキチン鎖を付加することで Rac1 のプロテアソーム分解を促進する分子として報告さ
れている 54,55。cIAP1 は、定常状態では折りたたまれた構造をしており、RING ドメインを
内側にした状態で不活性型のモノマーとして存在している。BV6 などの Smac-mimetic が
結合すると、2 量体化・活性化し、自身に K48 型ポリユビキチン化を付加することで分解
が亢進することが知られている 56–58。
Rac1(RAS-related C3 botulinus toxin substrate 1)は Rho GTPase ファミリーの一種であり、
細胞の遊走やエンドサイトーシスといった様々な細胞運動を制御するマスターレギュレー
ターとして知られている 59,60。また、Rac1 は様々な癌細胞において過剰発現や恒常活性化
変異が認められている分子であるため、癌細胞の転移を促進する癌遺伝子として知られて
いる 61–65。Rac1 の制御機構の一つに、ユビキチン化修飾が知られており、Rac1 がユビキチ
ン-プロテアソーム分解によって制御されていることや TRAF6 によりユビキチン化修飾を
受け、活性制御されていることが報告されている 54,66。
リソソームは 1955 年に de duve によって発見された細胞内の主要な分解を担うオルガネ
ラである。リソソームの内腔は v-ATPase の働きにより pH4.5~5.0 に酸性化されており、至
適 pH を保つことによって多くの加水分解酵素の活性を保っている。リソソームはエンド
サイトーシスやファゴサイトーシスによって形成されたエンドソームやオートファゴソー
ム内の生体分子を分解し、細胞に栄養分を供給する細胞内の恒常性の維持に欠かせないオ
ルガネラである。哺乳類の細胞には1細胞あたり、50 から 1000 個のリソソームが分布し
ているとされており、生体分子を分解するという役割から細胞のゴミ処理システムとして
呼ばれてきた。また、リソソームは他のオルガネラとは隔離され、局在なども変化しない
静的なオルガネラと考えられており、リソソームの研究は高度に専門化した研究領域にと
どまっていた。しかし、最近の研究により、リソソームは代謝シグナルや遺伝子制御とい
10
った様々な細胞プロセスに関与することが明らかになり、リソソームが細胞や生物の恒常
性を制御するための複雑な制御ネットワークの中心に位置するようになってきた 67。
リソソーム内腔 pH の上昇はリソソームの機能低下を引き起こし、リソソームストレス
を誘導する。細胞にはリソソームストレスに対応するためのリソソームストレス応答機構
が備わっている
68
。 リ ソ ソ ー ム ス ト レ ス 応 答 機 構 の 一 つ と し て 、 転 写 因 子 TFE3
(Transcription factor E3)の活性化によるリソソーム新生機構が存在する。TFE3 は定常状
態では細胞質にとどまっているが、リソソームの機能が低下すると核移行し、リソソーム
構成因子やオートファジーに関わる分子を転写誘導することでリソソームの恒常性維持に
重要な役割を果たしている 69,70。
リソソームに取り込まれることで薬効を発揮する薬剤は lysosomotropic agent と呼ばれて
いる 71。lysosomotropic agent は、リソソーム内に到達するとプロトン化され電荷を帯びる
ため、膜透過性が低下し、リソソーム内に蓄積する。その結果、リソソーム内の H+濃度の
減少、pH 上昇が誘導され、リソソーム内の加水分解酵素の活性が低下することでリソソー
ム分解が抑制される。クロロキン等の弱塩基アミンは lysosomotropic agent としてよく用い
られている 72。また、バフィロマイシン A1 は v-ATPase の活性を阻害することでリソソー
ムの酸性化を抑制する 73。最近、ゲフィチニブも lysosomotropic agent としてリソソームの
酸性化を抑制する薬剤として報告されている 74。
本研究では、ゲフィチニブの癌細胞における細胞応答を解析した結果、ゲフィチニブの
リソソームストレスを誘導するという性質がゲフィチニブによる癌細胞の転移抑制効果に
重要であることが明らかとなったとともに、新たなリソソームストレス応答機構が明らか
となった。
11
結果
第 1 章:分子標的薬ゲフィチニブによる副作用発症機構の解明
1-1.多種多様な TKI はゲフィチニブと同様に IL-1β の分泌を誘導する
前任者のマクロファージを用いた解析により、ゲフィチニブが炎症性サイトカイン IL1β の分泌を誘導し、炎症を引き起こすことが明らかとなった。そこで、ゲフィチニブの炎
症誘導作用がチロシンキナーゼ阻害作用によるものか、もしくはゲフィチニブの化学構造
的な特徴から誘導される作用によるものかを明らかにするため、ゲフィチニブと同様に
EGFR ファミリーを標的とする TKI を 5 種類、EGFR 以外の受容体型チロシンキナーゼを
標的とする TKI を 3 種類、非受容体型チロシンキナーゼを標的とする TKI を 1 種類選定
し、標的や構造の異なる多種多様な合計 9 種類(ゲフィチニブ含む)の TKI がゲフィチニ
ブと同様に IL-1β の分泌を誘導するか解析を行うことにした。選定した TKI は全て臨床で
炎症性副作用の存在が報告されている(Table. 1)。ヒトマクロファージ様細胞株 THP-1 細
胞に、選定した 9 種類の TKI を処置した結果、解析を行った 9 種類全ての TKI 処置によっ
て IL-1β の分泌が誘導されることが明らかとなった(Fig. 1A, B)。 ...