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in-cell NMR法による細胞内RASの活性型割合の観測とその制御機構の解明

趙, 慶慈 東京大学 DOI:10.15083/0002007120

2023.03.24

概要

審 査 の 結 果 の 要 旨

氏 名 趙 慶慈
in-cell NMR 法による細胞内 RAS の活性型割合の観測とその制御機構の解明、と題す
る本論文は、細胞内に導入した低分子量 GTPase RAS について、細胞内 NMR 観測法
(in-cell NMR 法) によって活性型である GTP 結合型の存在割合 (fGTP) を経時的に追
跡し、細胞内における RAS の GTP 加水分解速度定数 (khy) と GDP-GTP 交換速度定数
(kex) を解析したものである。本論文は全 4 章から構成されており、第 1 章では序論、第 2
章では実験方法を記述している。第 3 章の 3-1 節では同位体標識 RAS を用いた khy. kex
の解析系の確立について、3-2 節では in-cell NMR 法を用いた RAS の細胞内 fGTP や
khy,および kex の定量について、3-3 節では RAS の khy, kex に影響を与える細胞内因子の
探索について記述している。第 4 章では全体の結論と今後の展望を述べている。
本論文の内容について、まず NMR を用いた RAS の khy, kex の解析系について、イソロ
イシン (Ile) を選択的に 1H-13C 標識した RAS を調製し、NMR スペクトル上で GDP 結合
型と GTP 結合型に対応してシグナルが分離する Ile 21 のシグナル強度比から fGTP を算
出し、その経時変化から khy, kex を算出する方法を確立している。さらに、細胞内環境のよ
うにサンプル中の GTP 濃度を維持する GTP 再生系を用いて khy, kex を同時算出する方法
についても確立している。
続いて、in-cell NMR 法により取得した生細胞中の RAS の NMR スペクトルから各時間
における細胞内の fGTP を算出して追跡することにより、野生型 RAS および代表的な
RAS の発がん性変異体 (RAS/G12V, RAS/G13D, RAS/Q61L) について、いずれも細胞
内では fGTP が in vitro での値に比べて顕著に低下していることが明らかにしている。また、
in-cell NMR 実験において fGTP の経時変化が観測された RAS/G12V と RAS/Q61L につ
いて細胞内における khy および kex をそれぞれ算出することにより、いずれの変異体におい

ても細胞内では in vitro よりも khy が上昇、kex が低下しており、これらの反応速度の変化に
より細胞中での fGTP は in vitro よりも低く保たれていることを明らかにしている。
さらに、細胞名における RAS の活性の変調は既知の細胞内因子による寄与では説明で
きないことから、本論文では RAS の khy, kex に影響を与える細胞内因子を探索している。
まず細胞内の分子混雑環境、その中でも高粘性環境による分子拡散速度の低下が RAS
の kex を低下させることを明らかにしている。次に、細胞の破砕液上清の添加が RAS の
GTP 加水分解反応を促進させることを見出し、細胞破砕液上清から限外ろ過膜を用いて
調製した各分子量画分の加水分解促進効果を調べることにより、加水分解促進因子が分
子量 30K~50K のタンパク質成分であることを明らかにしている。さらに、分子量 30K~50K
の分子量画分中に含まれるタンパク質群をプロテオーム解析により同定し、そのタンパク
質群のうち TBC1D13 という因子について、RAS/G12V に対して一定の加水分解促進活
性を有することを明らかにしている。加えて、TBC1D13 は RAS/Q61L に対して RAS/G12V
よりも高い加水分解促進活性を示す一方で、野生型 RAS および RAS/G13D に対しては
加水分解促進活性を有さず、TBC1D13 の加水分解促進活性が RAS の変異体に対して
選択性を有することを明らかにしている。本論文中の in-cell NMR 観測結果において、
RAS/Q61L は RAS/G12V よりも in vitro 比で高い khy 上昇を示しており、また in vitro に対
する細胞中での RAS/G13D の fGTP 低下率は RAS/G12V, RAS/Q61L 変異体よりも小さ
かったことから、細胞中での khy の上昇に対して TBC1D13 および類似の機構を有するタ
ンパク質の寄与が存在することを提唱している。
がんの原因となるタンパク質 RAS について、本研究で明らかにした細胞内における
RAS の活性の変調、およびそれに影響を与える細胞内因子は RAS の細胞内活性制御
機構に重要な知見を与えるものであり、RAS を選択的かつ直接不活性化するような新規
のがん治療薬開発につながるものである。さらに本研究で確立した細胞内環境下での
RAS の活性状態を評価する手法は RAS の活性化を阻害する化合物をスクリーニングし
細胞内における薬効を正確に評価する上での活用が期待される。したがって、これらを行
った学位申請者は、博士(薬科学)の学位を得るにふさわしいと判断した。

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参考文献

1.

Wennerberg, K., Rossman, K. L. & Der, C. J. The Ras superfamily at a glance. J. Cell Sci. 118,

843–846 (2005).

2.

Milburn, M. V. et al. Molecular switch for signal transduction: structural differences between

active and inactive forms of protooncogenic ras proteins. Science 247, 939–945 (1990).

3.

Simanshu, D. K., Nissley, D. V. & McCormick, F. RAS Proteins and Their Regulators in Human

Disease. Cell 170, 17–33 (2017).

4.

Prior, I. A., Lewis, P. D. & Mattos, C. A Comprehensive Survey of Ras Mutations in Cancer.

Cancer Res. 72, 2457–2467 (2012).

5.

Pai, E. F. et al. Refined crystal structure of the triphosphate conformation of H-ras p21 at 1.35 A

resolution: implications for the mechanism of GTP hydrolysis. EMBO J. 9, 2351–2359 (1990).

6.

Hobbs, G. A., Der, C. J. & Rossman, K. L. RAS isoforms and mutations in cancer at a glance. J.

Cell Sci. 129, 1287–1292 (2016).

7.

Ahearn, I. M., Haigis, K., Bar-Sagi, D. & Philips, M. R. Regulating the regulator: posttranslational modification of RAS. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 39–51 (2012).

8.

Gorfe, A. A., Grant, B. J. & McCammon, J. A. Mapping the nucleotide and isoform dependent

structural and dynamical features of Ras proteins. Struct. Lond. Engl. 1993 16, 885–896 (2008).

9.

Marshall, C. B. et al. Probing the GTPase cycle with real-time NMR: GAP and GEF activities in

cell extracts. Methods 57, 473–485 (2012).

10. Smith, M. J., Neel, B. G. & Ikura, M. NMR-based functional profiling of RASopathies and

oncogenic RAS mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4574–4579 (2013).

11. Young, A., Lou, D. & McCormick, F. Oncogenic and Wild-type Ras Play Divergent Roles in the

Regulation of Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling. Cancer Discov. 3, 112–123 (2013).

12. Bollag, G. & McCormick, F. Differential regulation of rasGAP and neurofibromatosis gene

product activities. Nature 351, 576–579 (1991).

13. Boriack-Sjodin, P. A., Margarit, S. M., Bar-Sagi, D. & Kuriyan, J. The structural basis of the

activation of Ras by Sos. Nature 394, 337–343 (1998).

14. Taylor, S. J., Resnick, R. J. & Shalloway, D. Nonradioactive determination of Ras-GTP levels

using activated ras interaction assay. in Methods in Enzymology vol. 333 333–342 (Academic

Press, 2001).

15. Luchinat, E. & Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ 4, 108–118 (2017).

81

16. Serber, Z. et al. High-Resolution Macromolecular NMR Spectroscopy Inside Living Cells. J. Am.

Chem. Soc. 123, 2446–2447 (2001).

17. Sakakibara, D. et al. Protein structure determination in living cells by in-cell NMR spectroscopy.

Nature 458, 102–105 (2009).

18. Selenko, P. et al. In situ observation of protein phosphorylation by high-resolution NMR

spectroscopy. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 321–329 (2008).

19. Inomata, K. et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human

cells. Nature 458, 106–109 (2009).

20. Theillet, F.-X. et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells.

Nature 530, 45–50 (2016).

21. Kubo, S. et al. A Gel-Encapsulated Bioreactor System for NMR Studies of Protein–Protein

Interactions in Living Mammalian Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 1208–1211 (2013).

22. Mochizuki, A. et al. Balanced Regulation of Redox Status of Intracellular Thioredoxin Revealed

by in-Cell NMR. J. Am. Chem. Soc. 140, 3784–3790 (2018).

23. Zhao, Q. et al. Real-Time In-Cell NMR Reveals the Intracellular Modulation of GTP-Bound

Levels of RAS. Cell Rep. 32, 108074 (2020).

24. Ogino, S. et al. Observation of NMR Signals from Proteins Introduced into Living Mammalian

Cells by Reversible Membrane Permeabilization Using a Pore-Forming Toxin, Streptolysin O. J.

Am. Chem. Soc. 131, 10834–10835 (2009).

25. Schanda, P., Kupče, Ē. & Brutscher, B. SOFAST-HMQC Experiments for Recording Twodimensional Deteronuclear Correlation Spectra of Proteins within a Few Seconds. J. Biomol.

NMR 33, 199–211 (2005).

26. Tugarinov, V., Hwang, P. M., Ollerenshaw, J. E. & Kay, L. E. Cross-Correlated Relaxation

Enhanced 1H−13C NMR Spectroscopy of Methyl Groups in Very High Molecular Weight

Proteins and Protein Complexes. J. Am. Chem. Soc. 125, 10420–10428 (2003).

27. Mazhab-Jafari, M. T. et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve

membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6625–

6630 (2015).

28. Small, E. & Addinall, S. G. Dynamic FtsZ polymerization is sensitive to the GTP to GDP ratio

and can be maintained at steady state using a GTP-regeneration system. Microbiology, 149, 2235–

2242 (2003).

82

29. Scheffzek, K. et al. The Ras-RasGAP Complex: Structural Basis for GTPase Activation and Its

Loss in Oncogenic Ras Mutants. Science 277, 333–339 (1997).

30. Cherfils, J. & Zeghouf, M. Regulation of Small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiol.

Rev. 93, 269–309 (2013).

31. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem. Sci. 26,

597–604 (2001).

32. Pocker, Y. & Janjic, N. Enzyme kinetics in solvents of increased viscosity. Dynamics aspects of

carbonic anhydrase catalysis. Biochemistry 26, 2597–2606 (1987).

33. Klockow, B., Ahmadian, M. R., Block, C. & Wittinghofer, A. Oncogenic insertional mutations in

the P-loop of Ras are overactive in MAP kinase signaling. Oncogene 19, 5367–5376 (2000).

34. Yu, I. et al. Biomolecular interactions modulate macromolecular structure and dynamics in

atomistic model of a bacterial cytoplasm. eLife 5, e19274 (2016).

35. Scheffzek, K. & Shivalingaiah, G. Ras-Specific GTPase-Activating Proteins—Structures,

Mechanisms, and Interactions. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 9, a031500 (2019).

36. Davey, J. R. et al. TBC1D13 is a RAB35 Specific GAP that Plays an Important Role in GLUT4

Trafficking in Adipocytes. Traffic 13, 1429–1441 (2012).

37. Pan, F. et al. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin.

Nature 445, 433–436 (2007).

38. Gavriljuk, K. et al. Catalytic mechanism of a mammalian Rab·RabGAP complex in atomic detail.

Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21348–21353 (2012).

39. Janes, M. R. et al. Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor.

Cell 172, 578-589.e17 (2018).

40. Canon, J. et al. The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity.

Nature 575, 217–223 (2019).

41. Lee, K.-Y. et al. Two Distinct Structures of Membrane-Associated Homodimers of GTP- and

GDP-Bound KRAS4B Revealed by Paramagnetic Relaxation Enhancement. Angew. Chem. Int.

Ed. 59, 11037–11045 (2020).

42. Uhlen, M. et al. A pathology atlas of the human cancer transcriptome. Science 357, (2017).

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謝辞

本論文を作成するにあたり、本研究課題を行う貴重な機会とそのための最高の環境を与

えて下さり、また、数多くの大変貴重で的確な御指導、御助言、および励ましの御言葉を賜

りました、東京大学大学院薬学系研究科 生命物理化学教室 嶋田一夫 前教授 (現 国立研

究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター チームリーダー)に深く感謝致します。

本研究を遂行するにあたり、常に正しい方向を示し続けて下さり、研究活動の様々な面で

密接な御指導を直接賜りました、東京大学大学院薬学系研究科

紀貴 前准教授 (現 千葉大学大学院

生命物理化学教室

西田

薬学系研究院 薬品物理化学研究室 教授)に深く感謝

致します。

本研究に関して、セミナーなどを通じて多くの御助言を下さり、本研究がより良い内容と

なるように御支援いただきました、東京大学大学院薬学系研究科

生命物理化学教室

田卓見 准教授、幸福裕 助教に深く感謝致します。

本研究の実施にあたり、私の直属の先輩として細胞内に導入した RAS の in-cell NMR 観

測における様々な実験手法の基礎を築いていただいた東京大学大学院薬学系研究科

生命

物理化学教室 藤宮 瑠勇 修士に深く感謝いたします。

さらに研究に対して適切なご助言やご意見を頂けるだけでなく、研究生活を送る上で

様々な形でお世話になりました、東京大学大学院薬学系研究科

生命物理化学教室の皆様

に深く感謝致します。

最後に、これまでの27年間の長い間にわたって私を温かく見守り、支援してくださった

家族に心より感謝いたします。

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